酵母双杂交筛选与转录因子ZNF580相互作用的蛋白

目的: 寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白。方法: 以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步去除假阳性。随机挑取部分阳性克隆,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190 酵母菌进行一对一验证。分离阳性克隆质粒测序,并应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。结果: 确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。结论: 初步探讨了ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,为进一步研究转录因子ZNF580参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。     

应用酵母双杂交系统筛选Foxp3△2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cD-NA文库中筛选与转录因子Foxp3相互作用的蛋白,为进一步研究Foxp3的转录调控机制奠定基础。方法:首先构建pG-BKT7-Foxp3△2酵母双杂交诱饵载体,转化AH109酵母细胞,检测其毒性及自激活作用;然后将诱饵质粒与人外周血白细胞cDNA文库共转AH109酵母细胞,筛选了与Foxp3△2存在相互作用的蛋白。结果:成功构建了pGBKT7-Foxp3△2酵母表达载体,经转染AH109酵母细胞,无有毒性,无自激活作用。获得了40个阳性克隆,经生物信息学分析,其中9个具有开放读框。结论:应用酵母双杂交技术筛选出一组可与Foxp3△2相互作用的候选蛋白,为进一步研究Foxp3△2功能奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白

目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白。 方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证。结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白。通过GST pull down 实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用。结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1(1),pDBLeu-GATA1(2),pDBLeu-GATA1(3),筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

应用酵母双杂交系统研究与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白

目的用酵母双杂交系统筛选与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白,为该7肽在体内如何发挥功能提供线索。方法构建Ang-(1-7)的真核表达载体pBD—Ang-(1—7),转化酵母菌YRG-2,进行毒性和自身非特异激活性检验。与大鼠心肌细胞文库质粒共同转化酵母细胞,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选,选择既能在3重营养缺陷培养基上生长,也能使X—gal变蓝的克隆为阳性,提取靶质粒后进行复交,将真阳性质粒测序,进行生物信息学分析。结果诱饵载体构建成功并转化酵母,对酵母无毒性,无自身激活现象。筛选出的蛋白主要参与细胞代谢和蛋白合成。结论Ang-(1-7)可能影响细胞内某些蛋白合成和细胞代谢,发挥对血管紧张素Ⅱ的结抗作用。酵母双杂交结果为Ang-(1—7)的作用途径的进一步研究提供了分子生物学线索。     

酵母双杂交系统在膜蛋白相互作用研究中的应用

膜相关蛋白约占细胞总蛋白质中的1/3,它们大都参与了细胞的诸多生理、病理过程和药物反应机理.研究膜蛋白的相互作用对于揭示细胞的生命活动规律及寻找药物作用靶标都有重要的意义.由于膜蛋白本身的特性及其难以进入核内等原因,经典的酵母双杂交技术并不适用于检测膜蛋白间的相互作用.针对在活细胞中研究膜蛋白相互作用的需要,近年来国际上先后发展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母双杂交新系统,并取得了许多重要发现.     

利用酵母双杂交技术筛选与NMDA受体亚型NR2D相互作用的蛋白质

目的利用酵母双杂交技术,寻找可能与谷氨酸受体亚型NR2D存在相互作用的蛋白,为探讨NR2D蛋白在神经系统退行性改变中的作用提供依据。方法应用Clontech GAL4酵母双杂交系统,构建包含NR2D细胞内C末端的c DNA片段为诱饵质粒,筛选人脑c DNA文库;随机挑取部分阳性克隆,通过回复性杂交实验验证其可靠性,分离阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果筛选出6种与NR2D可能存在相互作用的蛋白,包括神经细胞膜糖蛋白(Glycoprotein M6B,GPM6B)、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1,SAT1)、乳酸脱氢酶B(Lactate dehydrogenase B,LDHB)、α-突触核蛋白(α-synuclein,SNCA)、淀粉样蛋白β前体蛋白结合家族B成员1和2(Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member1(Fe65),APBB1;Amyloid beta(A4)precursor protein-binding,family B,member 2,APBB2。结论初步探讨了NR2D蛋白的功能及与其可能发生互作的蛋白,为进一步研究谷氨酸的兴奋性毒性参与神经系统退行性改变的机制奠定了实验基础。     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

MIF活性区域相互作用蛋白的筛选

目的: 筛选与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)催化巯基蛋白质氧化还原酶(TPOR)活性域相互结合的蛋白。方法: 采用酵母双杂交系统进行筛选。首先构建pBTM116-MIF诱饵质粒,转化酵母菌株L40;将表达MIF催化 TPOR活性域的L40酵母菌株制备成感受态菌,在人骨肉瘤cDNA文库中筛选。通过组氨酸(HIS3报告基因活性和β半乳糖苷酶实验,初步确定与催化TPOR活性域片段相互作用的蛋白,最终通过免疫共沉淀和免疫荧光技术来确认。结果: 分别构建含野生型MIF的pBTM116-MIF和野生型硫氧还蛋白样蛋白2(TXNL2)的pACT2-TXNL2质粒,将其共转染L40酵母菌。HIS3报告基因活性检测和β半乳糖苷酶阳性实验结果提示TXNL2可能是与MIF催化 TPOR活性片段相互作用的蛋白。将重组质粒pcDNA3.1-Myc-TXNL2转染MCF7细胞,免疫共沉淀实验结果表明MIF抗体能够共沉淀Myc-TXNL2蛋白;免疫荧光结果显示Myc-TXNL2与MIF在细胞质中位置分布相同。结论: TXNL2可能是与MIF催化TPOR活性片段相互作用的蛋白。本研究为MIF氧化还原机制的研究提供了新的实验依据。     

Screening of APP interaction proteins by DUALmembrane yeast two-hybrid system

Alzheimer’s disease (AD) is one of the most common forms of neurodegenerative disease. There is a growing interest in the amyloid precursor protein (APP) over the years due to its involvement in AD. Besides its role in pathological mechanisms of AD, APP participates in many signaling pathways as well. APP functions through protein-protein interactions, and in this report staufen 1 (STAU1) is demonstrated to have interaction with APP, using yeast two-hybrid screening and co-immunoprecipitation in mammalian system. STAU1 belongs to the double-stranded RNA binding protein family and can mediate mRNA degradation in mammalian system, implicating that APP may be involved in the regulation of mRNA as well.     

细菌双杂交系统筛选与tumstatin45-132相互作用蛋白质

目的筛选与新生血管抑制剂肿瘤抑素功能性片段tumstatin45-132相互作用的蛋白质分子。方法构建诱饵蛋白载体pBT-tumstatin45-132,通过细菌双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库;克隆表达MBP-tumstatin45-132及候选蛋白His-MMP-2,利用MBP pull-down assay和蛋白质印迹方法验证pBT-tumstatin45-132与候选蛋白MMP-2间的相互作用。结果pBT-tumstatin45-132无自身转录激活活性,筛选人肝细胞cDNA文库,获得25个双阳性克隆,序列分析和同源检索表明所获其中之一候选蛋白为基质金属蛋白酶MMP-2;MBP pull-down assay和蛋白质印迹方法验证了pBT-tumstatin45-132与候选蛋白MMP-2间确实存在相互作用。结论　这些结果为进一步研究tumstatin45-132新的功能和机制创造了条件。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

应用细菌双杂交系统技术寻找与人PCIA1基因相互作用的基因

目的探寻与新近发现的人类交叉免疫反应抗原（homo sapiens cross-immune reaction antigen）基因PCIA1相互作用的基因,为其功能研究提供线索。方法应用Stratagene公司的细菌双杂交系统和人胚肾cDNA文库,构建诱饵质粒pBT-PCIA1,与靶质粒pTRG-cDNA文库大规模地共转化报告菌株,筛选并分离具有相互作用的pTRG-cDNA阳性克隆,经DNA序列分析和生物信息学确定靶基因。结果发现7种靶蛋白基因,其中3种基因功能尚不清楚,其余4种具有重要生理功能,突变或表达异常都会导致严重疾病;α-辅肌动蛋白-4（actinin,alpha4,ACTN4）、鞘脂激活蛋白原（prosaposin,PSAP）或真核翻译起始因子（eukary-otic translation initiation factor 3,subunit 10 theta,EIF3S10）过表达都会促进肿瘤发生和演进。结论细菌双杂交系统技术探测蛋白质之间的相互作用,是一种提供新基因功能研究信息的有效方法;PCIA1基因表达与肿瘤形成、侵袭和转移密切相关。     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.