应用嵌套式PCR法检测结核杆菌DNA

应用嵌套式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）法检测结核菌ＤＮＡ，所用内、外两对寡核苷酸引物衍生于３７．７ｕ（３８ｋＤａ）蛋白抗原ｂ的编码（Ｐａｂ）ＤＮＡ序列。对６种抗酸分枝杆菌和１０种非分枝杆菌ＤＮＡ进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实，只有人型结核杆菌、牛型结核杆菌和卡介苗（ＢＣＧ）出现３２２ｂｐ特异扩增带，而其他菌种未见此种扩增。第１步和第２步ＰＣＲ分别检测到的最低限量为１０ｐｇ和１０ｆｇ的靶ＤＮＡ。采用此法检测７２份临床标本，结果显示：该技术具有特异性强、敏感性高、快速简便的优点，尤适用于肺内外结核的早期诊断。     

用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

PCR法检测耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌的mecA基因

临床标本进行ＤＮＡ抽提后，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）将具有６２３个ｂｐ的耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的ｍｅｃＡ基因扩增，经琼脂糖电泳及ＤＮＡ印迹杂文（ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ），并用ＥＣＬ３’寡核苷酸标记增强化学发光进行检测，其结果与ＭＲＳＡ常规培养方法作比较。结果显示，７３份临床标本中，１５份常规培养法ＭＲＳＡ和ＰＣＲ法ｍｅｃＡ基因均为阳性，另１份ｍｅｃＡ基因扩增阳性的标本，常规培养ＭＲＳＡ为阴性。作者认为，由于ＰＣＲ对检测ＭＲＳＡ的ｍｅｃＡ基因具有快速、较强的特异性和敏感性等特点，作为检测临床标本中的ＭＲＳＡ的方法是可行的。     

抗登革病毒单克隆抗体诊断盒的应用

应用４株Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型登革病毒特异性单克隆抗体组成的诊断试剂盒，用荧光抗体技术特异而敏感地鉴定了Ⅰ～Ⅳ型登革病毒原型株和２０个地方株的型别．并于１９９０－１９９３年间广州市及佛山市登革热流行时，对从病人血清分离的登革病毒准确而快速地进行型别鉴定。     

石蜡分隔的热启动PCR技术扩增血清HBV-DNA

将聚合酶链反应（ＰＣＲ）成份分两组。先加一组含ｄＮＴＰｓ、引物和ＭｇＣｌ２，并加１粒组织切片用石蜡凝固为盖层。再加另一组反应液含待扩增模板、ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＫＣｌ，以与第一组反应液分隔。ＰＣＲ循环时高温可使中隔蜡层融化，两组反应液相混，蜡油上浮作为防蒸发屏障。由此避免室温混合加样和预置导致引物聚体形成和错导非特异扩增，提高ＰＣＲ特异性和灵敏性。作者应用这一技术检测５３例单项抗ＨＢｃ阳性血清，检出ＨＢＶＤＮＡ１３例，检测６９例ＨＢｓＡｇ阳性和抗ＨＢｅ阳性血清，检出ＨＢＶＤＮＡ６１例。而同样样本用标准ＰＣＲ检测，ＨＢＶＤＮＡ阳性分别为１０例和５２例。两种方法对ＨＢｓＡｇ和抗ＨＢｃ双阳性血清的ＨＢＶＤＮＡ检出率差别有显著意义（Ｐ＜０．０５）。     

PCR扩增法检测DMD患者的基因缺失

目的 探讨Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）患者基因缺失的突变特点并进行基因诊断。方法 用一对特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因ｅｘｏｎ４８附近的ＤＮＡ片段。结果 在２１例ＤＭＤ患者中，检出１６例患者的ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因在该处存在缺失突变。ｅｘｏｎ４８是ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因发生缺失突变“热点”区的观点。结论 该方法可用于ＤＭＤ的遗传咨询、基因诊断及产前基     

应用单管巢式多重PCR技术检测登革病毒及分型

目的建立一种单管巢式多重RT-PCR方法,以用于临床对于不同型别登革病毒混合感染的检测并分型。方法将1~4型登革病毒RNA混合,首先用1~4型病毒通用外引物进行一步法RT-PCR,然后以混合病毒RT-PCR产物为模板,在同一反应管内同时加入4对(5条)型特异性引物进行巢式多重PCR,结果用EB染色的3%琼脂糖凝胶电泳观察;并将其检测敏感性和特异性与该方法的单一病毒模板RNA扩增进行比较。结果经反应条件的优化,混合病毒模板单管巢式多重PCR可以在同一反应管内同时扩增出4条病毒特异性目的条带,分别为482、119、290、389 bp。其敏感性和特异性与单一病毒RNA的扩增相当,对模板RNA检测的敏感性可以达到66.068 copies/μl。结论该方法简便、快速、敏感、特异,可以根据扩增目的片段的大小进行诊断和分型,对于临床登革病毒混合感染病例的诊断和快速分型有应用价值。     

PCR法检测性反转综合征患者的SRY基因

为探讨Y染色体性别决定基因(SRY)在性分化中的作用,在染色体核型分析的基础上,应用聚合酶链反应(PCR)技术检测了6例性反转综合征患者的SRY基因。结果表明,3例46,XX男性患者中,2例SRY基因呈阳性,1例呈阴性;3例46,XY女性患者中,2例SRY基因呈阳性,1例呈阴性。提示SRY基因是性发育的重要遗传学基础,为性反转综合征的病因学研究及临床诊断提供资料。     

PCR法在疱疹病毒性脑炎诊断及疗效观察中的应用

选择疱疹病毒科病毒ＤＮＡ多聚酶基因高保守区中的一对引物，一次ＰＣＲ可同时扩增疱疹病毒科的４种病毒［单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ１）、单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ２）、ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、及巨细胞病毒（ＣＭＶ）］相应的ＤＮＡ片段。根据扩增产物分子的大小及对扩增产物酶切分析，可将标本中的４种病毒准确分型。用该法检测临床疑为病毒脑炎患者和其他中枢神经系统疾病患者（对照组）的脑脊液（ＣＳＦ），脑炎组ＣＳＦ阳性率３０％（９／３０），对照组ＣＳＦ阳性率６．７％（２／３０）；其中８例为ＨＳＶ１阳性，２例为ＣＭＶ阳性，１例为ＨＳＶ２阳性。２例病毒脑炎患者经用无环鸟苷抗病毒治疗７～１０ｄ后其ＣＳＦ中的ＨＳＶ１ＤＮＡ由阳转阴。由此说明ＰＣＲ法不仅可早期诊断疱疹病毒性脑炎，还可显示抗病毒药物的疗效。     

微孔杂交检测登革病毒及其分型方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒检测及分型方法：方法分析登革1～4型病毒基因组序列，分别设计针对登革病毒1～4型的特异性包被探针，扩增、克隆测序后包被聚乙烯微孔板。PCR上游引物5’端标记生物素，对待检样品进行扩增后用作检测探针进行微孔杂交（PC艮ELISA）反应，并通过设定不同的包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间．对PCR—ELISA反应进行优化：结果建立了快速，特异、敏感的登革病毒快速检测及分型方法．试验结果直观，阳性标本吸光度值存0．5以上，阴性结果吸光度值在0．1以下，S/N值在10以上。结论所建立的方法可用作登革病毒感染的早期诊断及分型。     

PCR法检测耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌的mecA基因

临床标本进行ＤＮＡ抽提后，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）将具有６２３个ｂｐ耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）的ｍｅｃＡ基因扩增，经琼脂糖电泳及ＤＮＡ印普杂交（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ），并用ＥＣＬ３｀寡核苷酸标记增强化学发光进行检测，其结果与ＭＲＳＡ常规培养方法作比较。结果显示，７３份临床标本中，１５份传阅耕ＭＲＳＡ和ＰＣＲ法ｍｅｃＡ基因均为阳性，另１份ｍｅｃＡ基因扩     

筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因

目的探讨最适退火温度和核酸扩增（PCR）周期,利用筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病（CML）的bcr-abl融合基因类型,并进行PCR荧光定量（RQ—PCR）,研究其与疾病的关系。方法通过改变PCR条件,将退火温度由55℃增加到60℃,反应周期由原来的30周期增加到45周期,检测14例22份标本。同时用荧光定量试剂检测标本。结果退火温度为58℃,45周期可测出10^3 copies／μl定量标准品的PCR产物。22份标本6cr-abl融合基因巢式PCR结果均阳性。其中b2a2型9份,b3a2型13份。定量检测18例阳性,量值在10^2-10^6copies／μg,两例急变患者急性期和慢性期有明显差异。结论筑巢式PCR是一种敏感而准确的检测方法,对bcr—abl进行定量有助于反映白血病细胞负荷、评价疗效及判断疾病预后。     

PCR扩增nuc基因快速检测金黄色葡萄球菌

为快速检测标本中金黄色葡萄球菌，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增金葡萄ｎｕｃ基因，并与培养法进行比较分析。结果只有金葡菌扩增出一条特异的ＤＮＡ条带，平行对照的其它菌株均为阴性，说明用ＰＣＲ检测金葡菌的方法简便、快速、特异、敏感。     

序列特异性PCR在HLA—DRB1基因分型的应用

参照ＨＬＡⅡ型基因序列设计８条序列特异性引物，应用分别代表ＨＬＡ－ＤＲ１－１８血清学特异性的１１株ＤＮＡ标准品建立序列特异性ＰＣＲ（ＰＣＲ－ＳＳＰ）和套式ＰＣＲ方法，并对６４例ＩＤＤＭ病人和７２例健康对照者进行ＨＬＡ－ＤＲＢ１基因分型。结果：（１）方法学鉴定示程序了各特异性引物均能从１１株ＤＮＡ标准口扩增出相应的等位基因，并能检出杂合子。除ＨＬＡ－ＤＲ３组特异引物对ＤＲ１发生交叉外，其余序列特异性     

PCR方法检测生殖道人乳头瘤病毒

探讨生殖道人乳头瘤病毒对宫颈糜烂的影响及摸索最佳的ＰＣＲ反应条件。方法应用通用引物介导聚合酶链反应法检测宫颈脱落细胞中ＨＰＶ。结果：健康人５０例,宫颈糜烂,患者３４例,ＨＰＶ阳性检出率为分别为２２．０％和４７．２％,两者差异显著。