骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化

背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.     

骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性

背景:在尿路缺损修复中,骨髓间充质干细胞-膀胱脱细胞基质复合物有望形成上皮层、肌层及血管化。目的:观察骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性。方法:将第4代兔骨髓间充质干细胞按1.0×109L-1种植于同种异体兔膀胱脱细胞基质支架上,以单独培养骨髓间充质干细胞为对照。绘制两组细胞生长曲线图,对比观察两条生长曲线有无差异。结果与结论:骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质表面能够很好的贴附、分裂生长,且细胞生长曲线与对照组相似,说明骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质表面生长良好,相容性较好。     

本期专题：脱细胞组织基质来源的生物材料（本刊中文部）

推荐理由：传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱，并进行支架材料的双面种植，但由于平滑肌细胞取材培养困难，且体外传代有限，双面种植较为困难。文章拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性。实验采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质，并测定其纯度及特性。将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上，     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景:骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议.目的:体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力.方法:分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化.另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周:单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照.结果与结论:小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达.小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34.提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力.     

种子细胞在膀胱重建中的研究进展

膀胱组织工程包括三大要素,即细胞支架、种子细胞和讯息因子,而种子细胞在构建组织工程化器官中有着不可替代的作用,是构建组织器官的基本原材料,选择一种既有良好组织相容性又容易获得的种子细胞成为器官重建工作成败的关键所在.目前常用的种子细胞有膀胱移行上皮细胞、膀胱平滑肌细胞、膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞,其中后两种细胞较其他细胞更有优势.种子细胞目前存在的问题:①已分化完全的成熟细胞的来源有限和免疫排斥.②已分化完全的成熟细胞在分化培养过程中只能进行有限的分裂传代,如果达到传代的极限,细胞将衰老并死亡;此外还存在去分化问题.③如何将膀胱移行上皮和平滑肌混合细胞、骨髓间充质干细胞培养成正常膀胱仍需进一步分析.     

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化.目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周.将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14 d.以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白l的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14 d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长.免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.透射电镜可见肌丝、Z线样物质.结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织.     

脱细胞角膜基质与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化活性人工角膜

目的:观察以脱细胞角膜基质作为支架材料、以骨髓间充质干细胞作为种子细胞复合构建组织工程化人工活性角膜的可行性。方法:实验于2004-09/2005-06在南昌大学江西医学院烧伤研究所完成。①取兔新鲜角膜,浸入1.25g/L胰蛋白酶和0.1g/L乙二胺四乙酸溶液中作用24h,然后浸入1%曲拉通X-100溶液中作用120h,制备成脱细胞角膜基质,进行常规组织学苏木精-伊红染色观察。②采用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化人骨髓间充质干细胞,用含10μg/L表皮生长因子的Dulbecco最低必需培养基进行诱导培养。③将经诱导培养的骨髓间充质干细胞种植于脱细胞角膜基质上,复合构建组织工程化人工活性角膜,观察细胞与材料的黏附、细胞增殖情况。结果:①脱细胞角膜基质主要由胶原纤维组成,未见细胞成分残留。②经表皮生长因子诱导培养的人骨髓间充质干细胞体外增殖良好,24h后贴壁细胞增多,7～10d细胞多为梭形,呈有规则的集束辐射状排列;14～21d左右细胞基本融合。③将人骨髓间充质干细胞种植于脱细胞角膜基质上,细胞铺展和增殖良好。结论:以骨髓间充质干细胞作为种子细胞复合脱细胞角膜基质支架材料可成功构建组织工程化人工活性角膜,有望成为一种修复角膜缺损的新技术方法。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化

背景:肝外胆管和胆囊上皮细胞的分离、纯化相对比较容易,但是胆管上皮细胞在体外易失去增殖能力,难以提供基础研究所需的细胞量,限制了胆管修复等基础研究的进程。虽然骨髓间充质干细胞可以转化为肝细胞,但是尚无体外培养骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的报道。目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为胆管上皮细胞的可行性。方法:采取全骨髓贴壁筛选法体外分离并纯化大鼠骨髓间充质干细胞后,在第3代骨髓间充质干细胞培养基中加入肝细胞生长因子和表皮生长因子,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态学变化,免疫荧光检测不同时间CK19的表达情况。结果与结论:在肝细胞生长因子和表皮生长因子的诱导下,骨髓间充质干细胞由梭形逐渐变为多边形、三角形;免疫荧光检查显示诱导第4周细胞膜开始表达CK19,诱导第6周CK19表达率明显提高。结果表明在两种细胞因子联合诱导下骨髓间充质干细胞能够转化为胆管上皮样细胞,从而为骨髓间充质干细胞修复损伤胆管提供了一个新思路。     

骨髓间充质干细胞增殖分化能力可随鼠龄增长而下降

背景：骨髓间充质干细胞是理想的组织工程种子细胞来源,但是不同年龄的骨髓间充质干细胞体外增殖、分化特点有很大差异,有关年龄与骨髓间充质干细数量的关系目前尚缺少系统研究。目的：观察不同鼠龄大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化活性的差异。方法：通过全骨髓贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜观察形态学特点,流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞、成软骨细胞分化并鉴定。取第3代2,4,6,8,12周龄和10,12月龄大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导1,2,3周,采用酶联免疫法检测骨钙素含量。结果与结论：体外培养的骨髓间充质干细胞为贴壁生长,长梭形成纤维细胞样细胞,可增殖形成克隆;流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD29、CD90表达阳性,CD45表达阴性,CD44部分表达;经成骨分化诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性,茜素红染色阳性;经成软骨分化诱导,阿利辛蓝染色阳性,可见通过全骨髓贴壁法可成功地从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。通过不同鼠龄骨髓间充质干细胞诱导成骨分化后骨钙素含量测定得出骨髓间充质干细胞增殖分化能力随鼠龄的增长而下降。     

联合应用生长因子促骨髓间充质干细胞向韧带样细胞分化

背景：利用生长因子诱导骨髓间充质干细胞定向分化成韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白是构建组织工程化韧带的关键。生长因子碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β1在细胞定向分化过程中都起着十分重要的作用。目的：采用转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。采用10μg/L转化生长因子β1和25μg/L碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间质干细胞进行诱导分化,分为空白组、转化生长因子β1组、碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组。观察生长因子对骨髓间质干细胞生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比骨髓间质干细胞分泌胶原蛋白量。把转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合诱导的骨髓间质干细胞使用BrdU荧光染色标记,然后移植到脱细胞真皮基质上,观察细胞增殖分布情况,并与空白组对照。结果与结论：转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子联合组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也较高。脱细胞真皮基质上,转化生长因子β1＋碱性成纤维细胞生长因子组细胞增殖分布情况明显优于空白组。提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激兔骨髓间质干细胞,能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

无细胞神经支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景：作者已经成功制备了无细胞神经移植物,并且复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。目的：无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损后运动功能的恢复。方法：成年雄性SD大鼠构建大鼠坐骨神经15mm缺损模型,分别应用组织工程人工神经、组织工程神经支架或自行神经桥接坐骨神经缺损。桥接后20周再生神经电生理学测定,手术侧胫骨前肌湿质量、腓肠肌组织学及透视电镜分析。结果与结论：桥接20周后,组织工程人工神经与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比较,差异无显著性意义（P〉0.05）,神经干传导速度为（30.56±2.15）m/s。结果提示,无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损后,可以促进再生神经运动功能的恢复。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨特征

背景：骨碎补能在促进骨生长且取得了良好的临床疗效,其主要成分柚皮甙能否诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化？目的：用柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。并观察柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。方法：用贴壁筛选法对兔骨髓间充质干细胞进行分离培养。对生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分别用50μg／L的柚皮甙和经典成骨诱导剂向成骨方向进行诱导,分别进行成骨鉴定。结果与结论：经典成骨诱导液、柚皮甙诱导液都能使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,基质分泌增多,形成钙结节。用酶联免疫检测仪检测柚皮甙诱导组和经典成骨诱导组细胞吸光度值未见明显的差异。同时检测柚皮甙诱导液和L—DMEN细胞培养液的吸光度值发现两者差异无显著性意义（P〉0．05）。证实柚皮甙可成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,无明显毒性作用。     

体外构建人工仿生骨膜

背景：小肠黏膜下层既具有良好的生物相容性和降解性,又富含多种生长因子,能明显促进细胞的黏附、增殖及分化,在国外已被广泛应用于骨与软骨、血管、皮肤、膀胱、平滑肌及胰岛等组织的修复,且已表现出良好的组织工程化细胞支架性能。 目的：探讨兔骨髓间充质干细胞经体外诱导成成骨细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜的可行性。方法：采用贴壁筛选法分离2周龄健康新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增培养、诱导分化及鉴定。将经成骨诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜,观察细胞在生物材料上的附着、生长、增殖情况。 结果与结论：接种5 d后,细胞散在附着于小肠黏膜下层材料上,细胞形态呈圆形,细胞之间无连接;10 d后细胞之间形成桥粒连接,成骨细胞伸出突起,与小肠黏膜下层贴附;15 d后细胞增殖,分泌基质,在小肠黏膜下层表面形成多层细胞组成的复层膜样结构。表明将骨髓间充质干细胞诱导成成骨细胞后与猪小肠黏膜下层复合可构建组织工程骨膜,有可能成为理想的组织工程支架材料。     

无细胞神经支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景:作者已经成功制备了无细胞神经移植物,并且复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。目的:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损后运动功能的恢复。方法:成年雄性SD大鼠构建大鼠坐骨神经15mm缺损模型,分别应用组织工程人工神经、组织工程神经支架或自行神经桥接坐骨神经缺损。桥接后20周再生神经电生理学测定,手术侧胫骨前肌湿质量、腓肠肌组织学及透视电镜分析。结果与结论:桥接20周后,组织工程人工神经与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比较,差异无显著性意义(P>0.05),神经干传导速度为(30.56±2.15)m/s。结果提示,无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损后,可以促进再生神经运动功能的恢复。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

膀胱无细胞基质移植物重建兔阴茎白膜的动态观察

背景:目前膀胱无细胞基质移植物已成功用于替代动物膀胱、尿道和修复尿道下裂,但膀胱无细胞基质移植物重建阴茎白膜有待观察.目的: 采用同种异体膀胱无细胞移植物替代兔阴茎白膜,观察重建修复效果. 设计:随机对照观察.单位:四川大学华西医学实验动物中心、华西组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室.材料:选用50只雄性健康封闭新西兰兔,动物级别3级,体质量为2.6～3.0 kg,均无包茎及阴茎发育不良,注射生理盐水后无阴茎弯曲,由四川大学华西实验动物中心提供.方法:实验于2005-12/2007-06在四川大学华西实验动物中心、四川大学组织工程实验室及贵阳医学院组织工程实验室完成.①取10只实验兔膀胱制备膀胱无细胞基质移植物.随机数字表法将40只新西兰兔分为对照组和膀胱无细胞基质移植物组,分别在阴茎背侧切除白膜10 mm×5 mm造成缺损,分别采用白膜原位缝合及膀胱无细胞基质移植物修复,每组20只.②分别于术后2,6,12及24周对2组动物进行阴茎海绵体内快速注射生理盐水诱导阴茎勃起,观察阴茎弯曲情况;于上述时间点分别处死实验兔,于术区取材进行苏木精-伊红、Masson染色观察修复部位组织结构变化;Stirus 染色检测检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积,免疫组化染色检测炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达.主要观察指标:①阴茎弯曲情况.②修复部位组织结构变化.③炎性标志因子诱导型一氧化氮合酶和促纤维化因子转化生长因子β1的表达.④Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维阳性面积.结果:纳入重建阴茎白膜术实验兔40只,2只死于麻醉药物过量,2只死于急性肠炎,其余36只均进入结果分析.①术后6周时弯曲发生率最高,对照组2例,膀胱无细胞基质移植物组1例;术后12周对照组及膀胱无细胞基质移植物组各1例发生弯曲;术后24周对照组1例发生弯曲,膀胱无细胞基质移植物组无弯曲发生.②修复部位组织结构变化:术后2周两组修复部位结构欠清,炎性细胞浸润明显,膀胱无细胞基质移植物组移植部位可见膀胱无细胞基质移植物内细胞生长,Masson染色显示术区白膜纤维纤细,排列欠规律.术后6周时白膜恢复完整性,膀胱无细胞基质移植物不能辨别,两组间无明显差异.术后24周移植部位白膜完整均匀,纤维恢复内环外纵排列,和正常白膜不能区别.③两组术后诱导型一氧化氮合酶及转化生长因子β1,2周表达最强,术后6周只有少数纤维细胞和血管内皮细胞有表达,术后12,24周仅有极少的血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1,同时间点2组诱导型一氧化氮合酶和转化生长因子β1没有差别.④术后2周两组Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维共同存在,比例相当.以后Ⅰ型胶原纤维逐渐增加,而Ⅲ型胶原纤维逐渐减少,术后24周以Ⅰ型胶原纤维为主,Ⅲ型胶原纤维已不明显.结论:膀胱无细胞基质移植物修复新西兰兔阴茎白膜无明显的炎症反应和纤维化,是较为理想的阴茎白膜修复材料.     

Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。