sKDR真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

研究获取可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)基因构建sKDR的真核表达载体,观察sKDR对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响.方法提取HUVECs总RNA,利用RT - PCR方法扩增KDR胞外免疫球蛋白1-3区基因片段,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1中,测序鉴定基因序列正确后,用脂质体法将重组质粒p...     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

变形链球菌pacA和gtfB-cat与ctxB嵌合表达质粒的构建及表达

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白。方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致。结论:成功构建了嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达。     

Construction and Expression of pacA and gtfB-cat of Streptococcus Mutans Fused with ctxB in Prokaryotic Cells

目的:构建含变形链球菌表面蛋白A区编码基因(pacA)、葡糖基转移酶催化区编码基因(gtfB-cat)及霍乱毒素B亚单位编码基因(ctxB)的嵌合表达质粒并表达目的蛋白.方法:将目的基因pacA、gtfB-cat、ctxB克隆至原核克隆载体pET32-a(+)构建嵌合质粒pET-pacA-cat-ctxB,将其转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3),并测量其表达情况.结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,证实目的基因均正确插入到载体pET-32a(+)中,插入的相位正确,未改变目的基因的阅读框架,经诱导后表达目的蛋白,分子质量大小与预期一致.结论:成功构建了嵌合质粒pET-pa-cA-cat-ctxB,且它们均在原核细胞内获得正确表达.     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

PEP-1-VP3融合蛋白的分离纯化与初步鉴定

目的构建融合蛋白PEP-1-VP3的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法通过PCR方法自PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒中扩增VP3基因,运用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性载体p ET15b-PEP-1中,构建重组表达质粒p ET15b-PEP-1-VP3,经测序证实构建成功后转化E.coli Rosetta,表达PEP-1-VP3融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲和层析,进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果成功构建PEP-1-VP3融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了17.6k D的PEP-1-VP3融合蛋白。结论所构建的PEP-1-VP3融合蛋白为体内抗肿瘤研究提供了理论基础。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

SATB1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建SATB1基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法将靶向SATB1基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pGCSIL-GFP中,获得pGCSIL—GFP-shSATB1质粒,经PCR和测序鉴定后与慢病毒包装质粒pGCSIL-GFP—shSATB1通过Lipofectamine2000共转染至细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实,SATB1shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×10^7pfu／ml。结论成功构建人SATB1基因慢病毒载体。     

猪干扰素-γ cDNA的克隆和原核表达

目的克隆猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,以实现猪干扰素-γ的大量生产。方法收集转染细胞(CHO-PCI-neo-PoIFNγ),用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA,并通过RT-PCR的方法扩增获得猪干扰素-γcDNA基因。将获得的猪干扰素-γcDNA基因克隆入原核表达载体pBV220中,组装成原核表达载体pBV220-cPoIFNγ。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株DH5α和BL21中,温度诱导培养后,进行SDS-PAGE实验检测。结果特异表达带约在17KD的位置,并证实在菌株DH5α和BL21中的表达量没有明显的差异,其表达量都约占细菌总蛋白的15%。结论成功地进行了猪的干扰素-γcDNA,并进行原核表达,为猪干扰素-γ的大量生产提供了可能。     

内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapid translation system)对其进行表达.方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E.coli)裂解产物中进行表达.应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定.结果:pIVEX2.3-G重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500可表达出分子量约为14.4的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白.结论:抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达.     

重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 :获得重组人白细胞介素 1 5 (rhIL 1 5 )高效表达菌株。方法 :经细菌脂多糖 +γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA ,用RT PCR方法扩增出编码人IL 1 5cDNA的基因片段 ,采用 pBV2 2 0表达载体 ,经DNA重组技术构建IL 1 5基因工程菌。结果 :核酸序列测定与预期一致 ,所表达的IL 1 5经SDS PAGE证明分子量约 1 5kD ,表达量占菌体总蛋白的 2 8% ,经CTLl2 细胞检测 ,表达产物粗提物 1∶1 0 0复性后效价可达到1 0 6IU /ml。结论 :构建的基因工程菌为IL 1 5高效表达菌株。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建细胞色素P450CYP2C19*1、*2、*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法:应用化学合成法合成CYP2C19*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建*2、*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot分别检测CYP2C19*1、*2、*3 mRNA以及蛋白的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19*1、*2、*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论:人CYP2C19*1、*2、*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

人IL—15cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建人白细胞介素－１５（ＩＬ－１５）ｃＤＮＡ真核表达载体,以期在哺乳类细胞中获得高效、稳定表达。方法 从外周血粘附性单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取总ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ,并与ｐｃＤＮＡ３．１质粒的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ位点定向连接,构建受控于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３１－ＩＬ－１５。结果 经ＰＣＲ扩增鉴定和ＤＮＡ序列分析,证明ＩＬ－１５已经正确插入克隆载体且序列正确。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达     

胆管癌相关FXYD6基因功能区在大肠埃希菌表达的初步研究

目的对胆管癌相关基因FXYD6基因的功能区进行克隆和表达,以便进一步展开该基因功能研究。方法借助生物信息学方法分析FXYD6基因,设计FXYD6基因信号肽剪切后功能区蛋白体外表达序列,并将其克隆到pBV220表达载体上,继而以大肠埃希菌为表达系统,使功能区蛋白（不含信号肽）获得体外表达。结果该基因主要功能位点位于18～95 aa。PCR扩增出剪切掉信号肽序列的功能区序列（即包含18～95 aa的肽链段）,并成功构建pBV220/FXYD6-ex基因功能区重组表达质粒克隆,其在大肠埃希菌DH5α中表达量最高,表达产物主要以包涵体形式存在。结论获得胆管癌相关FXYD6基因融合蛋白表达产物,为后续研究打下基础。     

人脂联素cDNA的克隆及序列分析

目的：构建人脂联素cDNA的克隆并进行序列分析。方法：提取人脂肪组织总RNA，运用RT-PCR方法扩增人脂联素cDNA完全编码区，将扩增产物通过TA克隆技术克隆至pMD18-T载体，对重组质粒进行测序验证。结果：成功构建人脂联素cDNA的克隆，重组质粒(pMD18-T／ADPN)经测序与Genebank检索的脂联素cDNA序列进行对比证实为100％同源。结论：所构建的人脂联素cDNA克隆适于进一步的克隆表达。