鼠疫耶尔森氏菌Pla蛋白的分离纯化与质谱分析

目的建立一种从鼠疫耶尔森氏菌疫苗株EV76中分离纯化纤维蛋白酶原激活因子（Pla）的方法。方法采用超声破碎与硫酸铵盐析结合的方法初步提取Pla,经CHT陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化,所获取的Pla进行质谱分析及Western blot实验。结果菌悬液超声破碎后上清以0~10%饱和硫酸铵沉淀,获得含有相对分子质量（Mr）约为31 000、35 000、37 000的3条Pla蛋白带,约占蛋白总量33%;CHT柱层析后,3条带约占蛋白总量80%。经质谱分析,在Mr约为31 000、35 000的条带中含有Pla,Pla单克隆抗体能特异性地识别该蛋白。结论采用超声破碎结合硫酸铵盐析的方法可从鼠疫菌中提取Pla,CHT柱层析可达到基本纯化,获得的样品经质谱分析和Western blot实验证实为Pla蛋白。     

高效液相色谱分离纯化鼠疫菌Pla蛋白

目的用高效液相色谱分离纯化鼠疫菌纤溶酶原激活因子。方法优化离子交换、凝胶过滤,并将2种层析组合实现纯化。结果用高效液相色谱纯化的Pla主要由相对分子质量约31×10^3、35×10^3、37×10^3的3条蛋白带组成,占蛋白总量80％以上。结论Pla经高效液相色谱分离可以达到基本纯化。     

中国鼠疫菌外膜蛋白种类的研究

目的：研究并分析中国各生态型鼠疫菌外膜蛋白种类及分子量。方法：鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE、)电泳系统分离鼠疫菌外膜蛋白。结果：在10％的SDS-PAGE上我国各生态型鼠疫菌37℃条件下的培养物所表达的外膜蛋白最多为26条蛋白带，而28℃培养物表达的外膜蛋白最多的则有36条蛋白带。结论：中国各生态型鼠疫菌外膜蛋白种类存在一定的差异，青海田鼠型菌株所产生的外膜蛋白与布氏田鼠型菌株相同。     

鼠疫菌外膜蛋白单克隆抗体制备及初步应用

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）、单克隆抗体（ＭｃＡｂ）等技术，对鼠疫菌外膜蛋白（ＯＭＰ）组成成分及免疫学特性进行了研究、在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上，鼠疫菌锡林郭勒高原型较其他型强、弱毒菌少一条亚基分子量为３２ＫＤ的蛋白带。以ＥＶ７６ｐ、ＥＶ苗的ＯＭＰ为免疫原，所获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，认为ＯＭＰ具有良好的免疫原性及免疫反应性。采用杂交瘤技术，得到七株抗鼠疫菌的ＭｃＡｂ。四株为ＩｇＧ，三株为ＩｇＭ。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定。四株ＭｃＡｂ抗ＯＭＰ的分子量，４Ｇ５株为２１０ＫＤ，３Ｂ９、ＩＤ１０株为４０ＫＤ，２Ｃ６株为１０ＫＤ。以七株ＭＣＡｂ对鼠疫菌强、弱毒株３２株作全菌体ＥＬＩＳＡ进行鼠疫菌分型的初步研究发现，３Ｂ９株ＭｃＡｂ与２４株强毒菌发生阳性反应，而不与弱毒菌反应；１Ｄ１０株与锡型及弱毒菌不发生反应，与其它强毒菌发生阳性反应。     

应用羟基磷灰石行牙颌整复

我们从1987年开始,经动物实验,临床应用山东工业陶瓷研究设计院研制的羟基磷灰石生物陶瓷(HAC),行颌骨缺损整复、人工牙种植。并发展了新用途,治疗根分歧下病变,用以保存牙齿。效果良好,现报告如下。一、动物实验以狗为对象,行植入实验:①羟基磷灰     

鼠疫菌外膜蛋白单克降抗体制备及初步应用

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋白免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ），单克隆抗体（ＭｃＡｂ）等技术，对鼠疫菌外膜蛋白（ＯＭＰ）组成成分及免疫学特性进行了研究。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱上，鼠疫菌锡林郭勒高原型较其他型强，弱毒菌少一条亚基分子量为３２ＫＤ的蛋白带。以ＥＶ７６Ｐ，ＥＶ苗的ＯＭＰ为免疫原，所获抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，认为ＯＭＰ具有良好的免疫原性及免疫反应性。采用杂交瘤技术，得到七株抗鼠     

我国各生态型鼠疫菌外膜蛋白的比较研究

目的 研究我国l7个生态型鼠疫菌的外膜蛋白谱型，为鼠疫菌分子生物学分型提供科学依据。方法 用终浓度为10g/L的氯霉素28℃下杀死鼠疫菌后，采用Trion—200改进法进行外膜蛋白的提取。以4％积层胶、12％分离胶行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳。根据低分子量标准蛋白和被试菌株的泳距作相关分析，得出各条蛋白带的相对分子量。结果 SDS—PAGE上各生态型鼠疫菌28℃培养物表达的外膜蛋白带在相对分子量大于40kD小于30kD的区域谱型基本一致，而在30-40kD之间稍有差异，岗底斯山型的部分菌株较141株多一条31．6kD带，锡林郭勒型菌株缺失32kD条带。结论 鼠疫菌的外膜蛋白，作为鼠疫菌种下的分类仅对田鼠型菌株意义较大。     

柞蚕丝素蛋白-羟基磷灰石-BMSCs组织工程化骨修复老龄动物骨缺损

目的 探讨柞蚕丝素蛋白-羟基磷灰石-骨髓间充质干细胞(TSF-HA-BMSCs)构成的组织工程骨对兔桡骨缺损的修复作用.方法 将TSF-HA与成骨诱导后兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行复合,构建新的组织工程骨.取36只12月龄老龄日本大耳白兔于左侧桡骨中段造15mm长的骨缺损区.实验分为3组(A、B、C组各12只).A组:TSF-HA+ BMSCs,B组:HA+ BMSCs,C组:无支架组.分别在术后8和12w摄取X线片,观察骨缺损区的修复及骨塑性情况,骨缺损区组织标本采取HE染色进行组织学观察,比较8和12 w各组的骨修复情况.结果 成功培养出了BMSCs,且细胞在材料表面生长状态良好.骨缺损修复术后8、12wX线检测显示,A组骨缺损的修复效果最好,B组次之,C组几乎没有修复作用,各组间差异有统计学意义(P＜0.05);HE染色表明,8w时与B组或C组相比,A组新骨生成最多,骨修复最快,差异有统计学意义(P＜0.05);12 w后取桡骨观察证实:实验组支架大部分被吸收,骨折处密度增高,骨质发白,实验对照组可见部分支架未被吸收,但骨折愈合良好;空白组骨缺损处被结缔组织填充覆盖.结论 TSF-HA组织程化骨具有很好的骨缺损修复能力,有望成为新骨缺损修复的替代材料.     

鼠疫菌纤溶酶原激活因子的分离纯化

目的 建立从人工培养的鼠疫菌中分离和纯化纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator,Pla)的方法.方法 分别用超声破碎、尿素提取与硫酸铵盐析相结合的方法(简称超声法、尿素法)提取Pla,并分别用离子交换、凝胶过滤两步层析相结合的高效液相色谱和制备电泳纯化Pla,对提取、纯化的Pla进行纤溶酶原激活剂活性检测.结果 鼠疫菌超声破碎上清50%～60%饱和硫酸铵沉淀和尿素浸渍菌粉上清0～10%饱和硫酸铵沉淀,均获得了3条蛋白带[相对分子质量(Mr)约31×103、35×103、37×103].纤溶酶原激活剂活性检测两种方法获得蛋白的溶圈直径分别为6.5、7.2 mm.用高效液相色谱纯化的Pla主要由Mr约31×103、35×1033、37×103的3条蛋白带组成,纤溶酶原激活剂活性检测溶圈直径为5.0 mm.制备电泳纯化的Pla主要由Mr约31×103、35×103、37×103的3条蛋白带组成.条带所在位置还有其他一些低浓度蛋白存在,纤溶酶原激活剂活性检测无溶圈出现.结论 超声法和尿素法可以提取到Pla,后者经高效液相色谱和制备电泳可以达到基本纯化.     

贵州省鼠疫耶尔森菌生物学特征研究

目的研究贵州省鼠疫耶尔森菌的生物学特征,探讨疫源地性质。方法对37株鼠疫菌进行生化试验、营养需求试验、毒力基因检测、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场电泳分析。结果37株鼠疫菌均不发酵鼠李糖和甘油,发酵麦芽糖和阿拉伯糖,脱氮阳性。选择20株代表菌株检测均为苯丙氨酸依赖(Phe )、谷氨酸半依赖(Glu±);用Pla、Cafl、inv、hms4对引物分别进行PCR扩增,均得到456、249、1000和700bp的目标基因条带;随机引物(RAPD)分析均获得505、790、1140和1680bp的条带;脉冲场电泳图谱显示338、242.5、168和77kbp的条带。结论贵州省鼠疫菌株的生物学特征与云南省滇闽居民生态型鼠疫菌相同。     

广西鼠疫菌生物学性状的研究

目的 研究广西鼠疫菌生化特性，确定该地区鼠疫疫源地的性质。方法 包括糖醇酵解试验、毒力因子检测、脱氮反应、营养需求等，采用Kado温和法提取质粒。结果 广西鼠疫菌对麦芽糖、阿胶糖酵解，而对鼠李糖、甘油不酵解。毒力因子(pgm)6株阳性，5株弱阳性、4株阴性。31株鼠疫菌经质粒图谱分析，其中2株菌缺失65MD，1株菌携带111MD大质粒，其余均含有4,6、45和65MD质粒。结论 按中国鼠疫菌生态分型标准，被试菌株属滇西闽居民区型。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

不同方式重组表达鼠疫caf1M蛋白的研究

目的对比不同方式克隆表达鼠疫耶尔森氏菌caf1M蛋白的存在状态及免疫学活性。方法分别选择3种不同载体pET32a(+)、pGEX4t-1、pGBTNH,克隆表达鼠疫caf1M蛋白;并以鼠疫菌免疫血清分别检测其免疫学活性。结果成功构建了4个重组质粒,分别是含去除信号肽编码序列caf1M基因的3个质粒载体,及1个含有完整caf1M基因的pGEX4t-1表达质粒;4个质粒经诱导均在大肠杆菌中得到高效表达;存在状态分析表明,含有去除信号肽编码序列caf1M基因的pGEX4t-1表达的重组蛋白以可溶方式存在,其余3种以包涵体形式存在;重组蛋白与鼠疫菌免疫血清的Western blot分析表明,除pGBTNH表达的蛋白存在非特异反应外,其余3种重组蛋白都发生特异性反应。结论成功克隆表达了4种鼠疫菌caf1M蛋白,其中3种具有良好的特异性免疫反应性;信号肽序列及载体都对重组caf1M蛋白的表达有影响。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫菌6MD质粒在假结核菌中的表达及其对假结核菌毒力的影响

使用电穿孔转化技术,将鼠疫耶尔森氏菌所携带的6MD 质粒转移到假结核耶尔森氏菌中,获得了杂交菌株。该杂交菌株能够表达鼠疫菌素Ⅰ及凝固酶,但其毒力却仍与作为受体的假结核菌株类似,而没有向鼠疫菌的毒力水平接近。本文对这种现象的可能原因进行了分析。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

我国鼠疫耶尔森菌毒力特征研究

目的 研究我国各疫源地分离的鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)毒力特征.方法 以1943-2012年我国11块鼠疫自然疫源地不同时间、地区、宿主、媒介体内分离的894株鼠疫菌作为研究对象.将每株菌的37℃24h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液,比浊后稀释为2×101、2×102、2×103、2× 104、2×l05、2× 106、2×107、2×108、2×109个/ml,分别取0.5 ml皮下注射于小白鼠鼠鼷部,每组5只动物,分笼饲养观察14 d,动物死亡后取淋巴、肝、脾、肺、心组织进行细菌培养,以分离出鼠疫菌为特异性死亡,并计算半数致死量(LD50).结果 894株代表性菌株中,87.36％(781/894)属于强毒菌,4.36％(39/894)为中等毒力株,8.28％(74/894)为弱毒菌;对不同生态型鼠疫菌株进行毒力比较,青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的青藏高原型、祁连山型鼠疫菌绝大多数属于鼠疫强毒株,分别占94.42％(457/484)、93.10％(27/29).结论 我国各鼠疫自然疫源地鼠疫菌的毒力特征以鼠疫强毒株为主.