呼吸道合胞病毒M2-1基因表达对人肺腺癌PAa细胞生物学特性的影响

目的观察呼吸道合胞病毒(RSV)M2-1基因的表达对人肺腺癌PAa细胞生物学特性的影响。方法①采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线和不同浓度丝裂霉素(MMC)作用下细胞的存活率;②采用流式细胞仪(FCM)、DNA凝胶电泳、透射电镜技术观察细胞凋亡。结果PAa/M2-1、PAa细胞的倍增时间分别为2.79和3.24d,PAa/M2-1细胞较PAa细胞生长速度快。不同浓度MMC作用下,转染后PAa/M2-1细胞的存活率均明显低于PAa细胞;PAa细胞和PAa/M2-1细胞的凋亡发生率分别为0.58%和5.6%;DNA凝胶电泳PAa/M2-1细胞可见清晰的DNA梯状条带;透射电镜观察到PAa/M2-1有凋亡细胞。结论M2-1基因的表达可促进PAa细胞生长,对不同浓度丝裂霉素表现为敏感性增加,并有自发性凋亡发生,以上结果为进一步研究RSV与肺癌的关系提供了有力证据。     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因转染对人肺腺癌细胞生长特性的影响

目的:探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)M2-1基因转染对人肺腺癌细胞体外生长特性的影响.方法:应用脂质体转染法,将携带M2-1基因的重组载体pXJ-41/M2-1转入人肺腺癌PAa和A549细胞,并获稳定表达;以不含M2-1基因的空白载体为对照,采用流式细胞术、MTT法、胰酶消化试验、软琼脂集落形成实验和Boyden小室等方法观察转染细胞的生长特性、贴壁能力及侵袭能力变化.结果:与转染前和转染空白质粒组比较,转染M2-1基因的PAa和A549细胞的G2/M期细胞比例均显著增加(P<0.05,P<0.01);细胞增殖明显加快(P<0.01),倍增时间缩短;集落形成率显著增加(P<0.01);PAa细胞胰酶消化离壁时间缩短(P<0.01),而A549细胞在3组间无统计学差异;Boyden小室实验中,A549细胞透膜数显著增加(P<0.01),而PAa细胞因透膜数很少,均无法计数.结论:M2-1基因转染能提高体外培养的PAa和A549细胞的增殖能力和侵袭能力,感染hRSV病毒的肺癌患者应引起重视.     

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染PAa和A549肺腺癌细胞系

目的探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)对肺癌细胞的影响。方法构建其转录调控因子M2-1基因真核表达质粒pXJ-41/M2-1,用DNA测序、酶切、PCR等方法鉴定基因重组情况。结果DNA测序表明该基因具有高度保守性;经脂质体转染、以-βactin为参照进行RT-PCR,筛选出了高效稳定表达M2-1基因的人肺腺癌PAa和A549细胞株,并经Westernblot验证有M2-1蛋白的表达。结论为进一步探讨M2-1基因在肺癌发生发展中的作用打下基础。     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

ndr2基因在肺腺癌细胞GLC-82中的诱导表达

目的 构建蜕皮素诱导的抑癌基因ndr2哺乳动物真核表达载体（pIND-ndr2)，转染肺腺癌细胞GLC－82，观察ndr2基因表达，为进一步研究ndr2的生物学功能打下基础。方法 以RT－PCR方法确定正常人肺组织和肺腺癌GLC－82细胞ndr2的表达高低。PCR方法扩增ndr2，以BamHI EcoRI双酶切连接入pUC19载体中，测序正确后，插入到蜕皮素诱导的真核表达载体pIND中。连有ndr2基因的载体（pIND-ndr2)用指质体方法转染到培养的肺腺癌细胞GLC－82中。经G418和zeocin双抗生素筛选后，挑取单克隆进行培养，用蜕皮素诱导ndr2表达，用RT－PCR，western印迹和免疫组织化学方法验证获得表达的细胞株。结果 PCR的方法扩增获得大小约1200bp的片段，连接入预先插入HA－tag的pUC19载体的ndr2基因经HindⅢ EcoRI酶切后，构建到真核表达载体pIND中，酶切鉴定后证明连接片段正确。通过双载体转染和双抗生素筛选后，培养的细胞经诱导后检测到实验组ndr2的高表达，而对照组和未诱导的实验组ndr2表达均较低。结论 ndr2基因成功转染培养的肺腺癌GLC－82细胞，建立了ndr2的可诱导表达的细胞系。     

Pokemon基因在非小细胞肺癌细胞系中的表达

目的 探讨pokemon基因在非小细胞肺癌细胞系中的表达情况.方法 采用RT-PCR、Western blot检测pokemon基因在5种人非小细胞肺癌细胞系中的表达.结果 pokemon基因在肺腺癌细胞系A549和AGZY83-a、肺鳞癌细胞系HE-99、肺巨细胞癌细胞系95D中呈高表达,在肺腺癌细胞系PAa中未见表达.结论 非小细胞肺癌细胞系中存在pokemon的表达.     

表达hCD4和hCCR5基因的骨髓间充质干细胞模型的建立

目的 研制一种能够表达hCD4和hCCR5基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)模型,以应用于Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)研究.方法 构建PLA.ExBi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR慢病毒载体,按最佳感染复数转染MSCs,荧光定量PCR检测hCD4和hCCR5的mRNA的表达,免疫印迹法检测MSCs中hCD4和hCCR5蛋白的表达,免疫荧光法检测hCD4和hCCR5荧光的表达;将建立的MSCs细胞进行HIV-1感染后,PCR检测HIV RNA的表达.结果 MSCs经转染慢病毒载体后,hCD4和CCR5 mRNA凝胶电泳可见193 bp和75 bp的阳性条带,mRNA的qRT-PCR检测可见其表达升高(P＜0.01);Western blot检测可见55.0×103 (hCD4)和40.6×103 (hCCR5)的阳性条带;免疫荧光成像可见存在CD4和CCR5的荧光表达,而空载慢病毒载体呈阴性.转染后MSCs细胞感染HIV-1后在培养细胞与上清液中HIV-1 RNA均显著升高(P＜0.05).结论 成功建立了高效表达hCD4/CCR5蛋白的骨髓间充质干细胞模型,具备对HIV-1易感的特性,可应用于HIV的发病机制、抗病毒、疫苗开发等研究.     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的ABCE1在人肺腺癌A549细胞增殖中的作用进行初步探讨。方法以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,针对其ABCE1基因序列设计小干扰RNA片段,重组其短发夹状RNA（shRNA）表达载体,转染入细胞。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）方法分别检测转染后ABCE1的mRNA和蛋白的表达水平,MTT法检测增殖能力。结果RT-PCR和Western blot显示shRNA对ABCE1基因和蛋白水平均有显著的下调作用。人肺腺癌A549细胞的生长速度减慢。结论下调ABCE1基因后,A549细胞的增殖能力得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗A549的靶点之一。     

含绿色荧光蛋白和PLCZ的逆转录病毒载体的构建及其在SHG44细胞中的表达

目的构建含有PLC-γ1分子Z区(PLCZ)和绿色荧光蛋白基因的双顺反子逆转录病毒载体,并将其导入SHG44胶质瘤细胞中,以探索PLC-γ1分子对胶质瘤细胞侵袭作用的影响. 方法 PCR法扩增PLCz基因,测序后克隆入pIRES-EGFP荧光蛋白表达载体中,酶切鉴定重组体. 将PLCz-IRES-EGFP片段克隆入逆转录病毒载体pLXSN的相应位点,构建含有PLCz和EGFP基因的逆转录病毒载体,脂质体介导下转染包装细胞PA317,G418筛选并检测病毒滴度后挑选细胞克隆. 病毒上清感染人脑胶质瘤SHG44细胞,G418筛选获得稳定转染细胞,PCR检测外源基因的整合,Northern blot检测外源基因的转录,Western blot和荧光显微镜分别检测PLCz分子和EGFP的表达. 结果 PCR扩增得到大小约650 bp的特异性条带,序列测定结果与发表序列一致. 构建得到含有PLCz和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒载体,转染人脑胶质瘤细胞SHG44,得到稳定转染的细胞株SHG44-PIE. PCR扩增显示目的片段已整合入细胞基因组. Northern blot分析显示为单一的转录本. Western blot可见大小约50×103的特异性条带,荧光显微镜检测显示EGFP获得良好表达. 结论成功构建含有PLCz和绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体,并获得稳定转染该载体的SHG44胶质瘤细胞株.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。