筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒LO2稳定株差异表达基因和基因通路

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60％.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细?     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞增殖和细胞周期的影响

摘 要：目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞增殖和细胞周期的影响,探讨HCV-NS4B在HCV致病中的可能机制。方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2及重组质粒PCXN2-NS4B转染入 LO2肝细胞,G 418筛选。RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内。MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA、cyclinD1的表达情况。结果 NS4B转染入LO2有表达;绘制生长曲线示NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测显示转染空载体PCXN2的细胞57.73％±19.73％进入G0/G1期、29.25％±6.95％进入S期、6.80％±4.67％进入G2/M期;转染PCXN2-NS4B的细胞46.89％±5.60％进入G0/G1期、36.31％±4.36％进入S期、16.80％±6.79％进入G2/M期;转染NS4B的细胞PCNA、cyclinD1表达率较转染空白载体组高,两组比较差异有显著性（P<0.01）。结论 HCV-NS4B可能通过调节某些基因转录与表达,促进DNA合成,干扰肝细胞周期,促进肝细胞增殖。     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因,并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中,再与表达载体ｐＭＳＧ重组,以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞,经地塞米松（ＤＭ）诱导,采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体，为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因，克隆到pGEM-T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体，Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在，融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论：HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒NS4B调控肝细胞凋亡的相关机制研究

目的：研究HCV—NS4B对肝细胞Caspase-3及Survivin表达的影响,探讨HCV—NS4B对肝细胞凋亡的影响及相关机制。方法：通过转染丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV—NS4B）至L02肝细胞中,设置三组细胞（空白对照组、空白载体PCXN2组、PCXN2-NS4B组）,利用流式细胞仪检测各组Caspase-3的表达情况,免疫组化方法观察三组中Survivin的表达情况。结果：PcxN2-Ns4B转染入LO2细胞并有稳定表达,流式细胞术检测各组Caspase-3的表达情况：空白对照组、转染PCXN2组及PCXN2-NS4B组均有Caspase-3表达,分别为：（23．45±1．57）％、（23．17±1．79）％及（4．34±0．59）％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。免疫组化方法检测Survivin的表达情况：空白对照组阳性表达率为25％,PCXN2组表达率为16．67％,PCXN2-NS4B组表达率为75％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：①NS4B转染入肝细胞后有稳定表达;②NS4B可抑制Caspase-3表达、促进Survjvin的表达;③HCV～NS4B可能抑制Caspase-3表达、促进Survivin的表达而抑制肝细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B的研究进展

丙型肝炎(HCV)为全球流行性疾病,据估计全球HCV感染者超过1亿人.每年受HCV新感染者在100万以上.HCV是一个单股正链RNA,属黄病毒科,编码约9600个核苷酸,可分为5'末端、3'末端和位于两个末端之间的约9400个核苷酸的开放读码框,编码由3010或3011个氨基酸组成的前蛋白多肽.     

HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对P53表达的影响

目的了解丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p5 3表达的影响 ,探讨其在肝癌发生中的作用 ,及其发生机制。方法使用脂质体介导法 ,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2 NS4B及突变型p5 3基因重组质粒P5 3 CX2 2AN3进入Chang肝细胞内 ,并用G4 18筛选获得稳定表达细胞 ,分别采用细胞化学法检测p5 3表达率。设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组 ,转染p5 3组、共转染NS4B及p5 3组。结果空白对照组无p5 3表达 ,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达 ,转染p5 3组及共转染组呈阳性表达 ,与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较有显著差异 ,P <0 .0 1。结论NS4B可能抑制突变型p5 3表达 ,也可能阻止其进入细胞核。     

丙型肝炎病毒1b基因型C区氨基酸70替代对细胞凋亡的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV） 1b基因型（genotype 1b,GT-1b）C区氨基酸（amino acid,AA） 70替代对细胞凋亡的影响.方法 利用前期构建的HCV GT-1b C区aa70野生型和变异型核心蛋白表达质粒瞬时转染体外培养肝瘤细胞系,采用PCR芯片检测细胞凋亡相关基因的表达,并以Annexin-V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率.结果 与野生型核心蛋白相比,转染表达变异型核心蛋白可使Huh7细胞84个凋亡相关基因中40个表达相对增强,44个表达相对减弱,但相差倍数均在3倍以内.HepG2细胞转染野生型和变异型核心蛋白表达质粒后,细胞凋亡率分别为9.4％±1.9％、9.1％±2.2％,低于空白载体对照组的14.3％±1.4％;以抗Fas抗体处理后,细胞凋亡率增高（52.4％±2.9％、56.1％±2.5％）,但仍明显低于空白载体对照组的72.6％±2.1％.结论 HCV核心蛋白表达可抑制细胞凋亡,但核心蛋白单纯R70Q/H变异并不足引起细胞凋亡相关基因表达及凋亡率的显著不同.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的 建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响.方法 双酶切质粒pXT1 -X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em;分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm,再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3,1（-）,构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm,经酶切鉴定及测序正确后,通过脂质体转染至P815细胞,持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT—PCR,IFA,Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm,建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体,稳定转染P815细胞,为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响

目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

Expression of cytokines in mouse hepatitis B virus X gene-transfected model

The expression profile in the mouse hepatitis B virus X (HBx)-transfected model was investigated in order to lay a foundation for further study on the implication of cytokines expression in hepatitis B virus (HBV) infection.Hydrodynamic injection method via the tail vein was used to establish the animal HBx-transfected model.By using microassay,the differential expression of gene in each group was analyzed,which was further confirmed by using real-time PCR and semi-quantitative PCR.Most of chemokine genes such as Ccl2,Ccl5,Ccl9,MIG and IP-10 were up-regulated in the HBx-transfected mouse model versus the control mice,which was coincided with the microarray results.Western blotting and immunohistochemistry were applied to detect the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues.Simultaneously,ELISA was adopted to measure the content of IFN-γ in the liver tissues.DNA microassay revealed that the expression of 611 genes changed in HBx-transfected mice as compared with that in pCMV-tag2B-transfected mice,and most of the screened chemokines were up-regulated (including MIG and IP-10).Additionally,IFN-γ protein levels were increased by 20.7% (P<0.05) in pCMV-tag2B-HBx-transfected mice as compared with the untreated mice.IFN-γ protein levels were reduced by 53.9% (P<0.05) in pCMV-tag2B-transfected mice as compared with the untreated mice,which was consistent with the up-regulation of MIG and IP-10.It was suggested HBx transfection could induce the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues,which might play the roles in HBV-related liver immunity and cytokines-mediated antiviral effect.     

乙型肝炎病毒C基因多态性及其蛋白特性分析

目的:调查温州医学院大学生人群乙型肝炎病毒(HBV)C基因多态性及其HBc蛋白特性变化,为了解乙肝病毒核心抗原(HBcAg)变异提供理论依据。方法:采用HBV-C基因特异性引物对21份温州医学院大学生HBV携带者(血清学检测为大三阳患者)血清标本进行PCR扩增鉴定,并取19份PCR检测阳性产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNA Star软件分析HBV-C基因多态性及HBc蛋白特性的变化。结果:21份标本中,HBV-C DNA阳性率达90.48%(19/21),与标准基因序列(Gen Bank X01587)比较,HBV-C基因同源性为93.3%～95.1%。HBV-C基因分别形成51种突变模式,其中一处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也发生了相应的改变,此处氨基酸序列的第130处脯氨酸(Pro)突变为苏氨酸(Thr),其余标本均为同义突变;但突变处编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性与标准株相比较无明显变化。结论:温州医学院大学生HBV携带者的HBV C基因具有多态性,但是由C基因决定的核心蛋白序列相对保守。     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.