筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒LO2稳定株差异表达基因和基因通路

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60％.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细?     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞增殖和细胞周期的影响

摘 要：目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞增殖和细胞周期的影响，探讨HCV-NS4B在HCV致病中的可能机制。方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2及重组质粒PCXN2-NS4B转染入 LO2肝细胞，G 418筛选。RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内。MTT法绘制生长曲线，观察NS4B对肝细胞生长的影响；流式细胞仪检测细胞周期的情况；免疫组化方法观察PCNA、cyclinD1的表达情况。结果 NS4B转染入LO2有表达；绘制生长曲线示NS4B可促进肝细胞生长；细胞周期检测显示转染空载体PCXN2的细胞57.73％±19.73％进入G0/G1期、29.25％±6.95％进入S期、6.80％±4.67％进入G2/M期；转染PCXN2-NS4B的细胞46.89％±5.60％进入G0/G1期、36.31％±4.36％进入S期、16.80％±6.79％进入G2/M期；转染NS4B的细胞PCNA、cyclinD1表达率较转染空白载体组高，两组比较差异有显著性（P<0.01）。结论 HCV-NS4B可能通过调节某些基因转录与表达，促进DNA合成，干扰肝细胞周期，促进肝细胞增殖。     

表达HCV NS3蛋白肝细胞中ERK与NF-κB信号转导通路间的cross-talk研究

目的:研究表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(hepatitis C virus non-structural protein 3, HCV NS3)的肝细胞中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)与核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号转导通路间的cross-talk.方法:真核表达质粒pcDNA3.1-NS3转染人源永生化肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV NS3蛋白的细胞株QSG7701/NS3.在丝裂原活化蛋白激酶的激酶(MAP kinase kinase, MEK)抑制剂PD98059(0,30,50,100μmol/L)处理细胞QSG7701/NS3前后,利用Western免疫印迹检测ERK的磷酸化水平及细胞周期素D1(cyclin D1)蛋白的表达;凝胶电泳阻滞迁移试验检测转录激活因子1(activator protrin 1, AP-1)、NF-κB等转录因子活性的改变;流式细胞术检测细胞周期各期百分数的改变;MTT比色法观察其对细胞增殖的影响.结果:HCV NS3蛋白能上调QSG7701细胞的ERK磷酸化水平及cyclin D1的表达水平;PD98059抑制HCV NS3蛋白介导的细胞增殖,下调AP-1和NF-κB的活性及cyclin D1的表达.结论:在表达HCV NS3蛋白的肝细胞中,ERK抑制剂能抑制肝细胞增殖,并呈明显的剂量依赖关系.ERK与NF-κB信号转导通路间可能存在cross-talk,并在肝细胞的增殖和恶性转化中发挥协同作用.     

丙型肝炎病毒NS4B调控肝细胞凋亡的相关机制研究

目的：研究HCV—NS4B对肝细胞Caspase-3及Survivin表达的影响,探讨HCV—NS4B对肝细胞凋亡的影响及相关机制。方法：通过转染丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV—NS4B）至L02肝细胞中,设置三组细胞（空白对照组、空白载体PCXN2组、PCXN2-NS4B组）,利用流式细胞仪检测各组Caspase-3的表达情况,免疫组化方法观察三组中Survivin的表达情况。结果：PcxN2-Ns4B转染入LO2细胞并有稳定表达,流式细胞术检测各组Caspase-3的表达情况：空白对照组、转染PCXN2组及PCXN2-NS4B组均有Caspase-3表达,分别为：（23．45±1．57）％、（23．17±1．79）％及（4．34±0．59）％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。免疫组化方法检测Survivin的表达情况：空白对照组阳性表达率为25％,PCXN2组表达率为16．67％,PCXN2-NS4B组表达率为75％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：①NS4B转染入肝细胞后有稳定表达;②NS4B可抑制Caspase-3表达、促进Survjvin的表达;③HCV～NS4B可能抑制Caspase-3表达、促进Survivin的表达而抑制肝细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞周期及PCNA表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B对肝细胞细胞周期及PCNA表达的影响,探讨HCV-NS4B在肝细胞增殖机制中的可能作用.方法 利用脂质体介导将空白载体PCXN2组及重组质粒PCXN2-NS4B转染入LO2肝细胞,G418筛选.RT-PCR鉴定质粒成功转染入肝细胞内.MTT法绘制生长曲线,观察NS4B对肝细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期的情况;免疫组化方法观察PCNA的表达情况.结果 NS4B转染入LO2有表达,生长曲线示HCV-NS4B可促进肝细胞生长;细胞周期检测示转染PCXN2-NS4B组S期、G2/M期较PCXN2组增加,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);转染PCXN2-NS4B组PCNA表达率较PCXN2组高,两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HCV-NS4B可能通过调节PCNA的表达,促进DNA合成,促进肝细胞增殖.     

野生型DJ-1 与A39S 突变型DJ-1 表达的单克隆细胞株基因表达谱分析

目的：探讨DJ-1 基因A39S 突变在帕金森病发病过程中的作用机制,以及其是否可能通过转录调控活性
导致相关基因表达异常。方法：建立能够稳定表达空载体和野生型DJ-1 蛋白,以及A39S 突变型DJ-1 蛋白的HEK293
单克隆细胞株。利用基因芯片技术对不同组别细胞株进行差异性表达基因筛选。结果：与空载体组比较,野生型
DJ-1 组有14 个基因表达上调,28 个基因表达下调;A39S 突变型DJ-1 组有6 个基因表达上调;2 个基因表达下调;
A39S 突变型DJ-1 组与野生型型DJ-1 组比较发现只有1 个基因表达下调。具有表达差异性的基因分别参与信号转导、
基因转录调控、细胞周期、细胞凋亡、氧化应激等生物学过程。结论：A39S 突变型DJ-1 蛋白可能通过直接或间接方
式对这些差异基因进行表达调控影响这些通路的正常功能,而参与帕金森病的发病。     

HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

羟基喜树碱抑制肺癌A549细胞的体外增殖并下调Bcl-2基因的表达

摘要：目的研究羟基喜树碱对肺癌A549细胞生长抑制、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法羟基喜树碱处理A549细胞后用吖
啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色观察细胞形态学变化,琼脂糖凝胶检测DNA片段化,用流式细胞仪测定其对细胞周期影响。利用
Annexin V-FITC/PI 检测细胞凋亡,RT-PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2 的表达变化。结果A549 细胞经羟基喜树碱作用,提取
DNA进行琼脂糖凝胶电泳可见梯状条带。经AO/EB染色,荧光显微镜下观察到早期凋亡细胞细胞核被染成绿色,呈碎片状,晚
期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状,细胞周期S期由20%升高到60%。经1 μmol/L 羟基喜树碱处理24 h后,流
式细胞术显示A549细胞的凋亡率为18.11%,明显高于对照组细胞凋亡率（0.09%,P<0.05）。经羟基喜树碱作用后,A549细胞
Bcl-2基因表达下调70%（P<0.05)。结论羟基喜树碱可以明显抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡,并下调Bcl-2基因表达,提示
Bcl-2下调参与了羟基喜树碱对A549细胞的抑制作用。
     

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。     

硫利达嗪诱导SW480细胞凋亡的机制

目的研究硫利达嗪对结肠癌SW480细胞增殖及凋亡的影响。方法应用5~30 μmol/L硫利达嗪处理SW480细胞,MTT
法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期;
RT-qPCR分析PDCD4、c-MYC、BCL2、CCND1、CASPASE3、PARP1、CDK4、EIF4A基因表达水平;Western blotting 检测AKT、
p-AKT、PDCD4蛋白表达水平。结果MTT结果表明硫利达嗪抑制SW480细胞的增殖,硫利达嗪处理细胞后出现核固缩、染色
质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征;流式检测表明硫利达嗪诱导G0/G1期阻滞,细胞凋亡增加。RT-PCR结果表明硫利达
嗪处理细胞后PDCD4表达上调,CCND1、CDK4、c-MYC、BCL2、CASPASE3、PARP1和EIF4A表达下调。免疫印迹分析结果显
示PDCD4蛋白表达上调,p-AKT蛋白表达下调。结论硫利达嗪能够抑制人结肠癌SW480细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制
可能与抑制PI3K/AKT信号通路导致PDCD4表达水平升高有关。
     

差异基因表达谱分析颈动脉不稳定斑块相关基因及可能的信号通路

目的探讨颈动脉不稳定斑块发生的分子机制。方法从ArrayExpress数据库下载基因表达谱数据E-MTAB-2055。该数
据包含24例颈动脉不稳定斑块和24例稳定斑块组织,从中筛选差异基因,并通过富集分析获取与不稳定斑块有关的生物学过
程和通路。同时,通过构建差异表达基因的生物网络来寻找与该疾病高度相关的风险模块,并用荧光定量PCR法检测五对不稳
定斑块和斑块旁标本,验证风险模块中部分基因的差异表达。结果不稳定斑块中发生显著性差异表达变化的基因共有439
个,其中上调基因为232个,下调基因为207个。涉及到的生物学过程和通路大部分与炎症和免疫应答有关。生物网络和模块
分析提示CXCR4、VCL和TYROBP 可能在不稳定斑块发生发展过程中发挥着重要作用。荧光定量PCR结果显示CXCR4和
TYROBP基因表达情况与芯片数据分析结果一致。结论本研究比较完整地揭示了不稳定斑块差异表达谱特征和所涉及的生
物学过程和信号通路,其中TYROBP可能是不稳定斑块发生发展进程中新的致病基因。
     

Sox2 下游调控蛋白的筛选及其对大肠癌细胞增殖、迁移的影响

目的分析大肠癌细胞转录因子Sox2对大肠癌细胞增殖及迁移的影响。方法应用SDS-PAGE蛋白电泳,结合考马斯亮
蓝及镀胺银染色方法,筛选差异蛋白。质谱分析筛选Sox2下游调控蛋白,应用定量PCR（QPCR）及Western blotting验证和鉴定
下游调控蛋白。Cell Counting Kit-8（CCK8）观察Sox2对大肠癌细胞增殖的影响,Transwell实验观察Sox2对迁移能力的影响。
结果应用蛋白组学技术成功筛选出Sox2下调蛋白S3a、上调蛋白ENO1、Gama-actin。QPCR和Western blotting显示,Sox2过
表达后,大肠癌细胞S3a表达减少（P<0.005）,ENO1表达增加（P<0.05）,Gama-actin表达无明显差异,细胞增殖及迁移能力提高
（P<0.05）;Sox2干扰后,大肠癌细胞S3a表达增加（P<0.05）,ENO1表达减少（P<0.001）,Gama-actin表达无明显差异,细胞增殖
及迁移能力下降（P<0.05）。结论Sox2负向调控S3a的表达,正向调控ENO1的表达,促进大肠癌细胞增殖及迁移。
     

miR-590-5p和miR-590-3p参与肝细胞肝癌发展的机制

目的研究miR-590的两个臂—miR-590-5p和miR-590-3p对肝癌细胞增殖能力的影响,以及参与肿瘤发生发展的机制。
方法利用miRNA芯片、QPCR对肝癌标本和各细胞株miR-590的表达谱系进行分析和验证。通过脂质体将miR-590 mimic或
inhibitor 转染正常肝细胞或肝癌细胞,MTT生长曲线分析和软琼脂克隆形成实验检测转染后细胞增殖及存活能力的变化。
Targetscan预测miR-590-5p和miR-590-3p的靶基因,并通过萤光素酶报告系统以及western blot进行验证。结果miRNA芯片
结果显示3个肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）组织相对于癌旁正常组织,miR-590-5p和miR-590-3p表达上调。通
过QPCR验证了10 例临床HCC肿瘤标本发现80%的HCC组织相对于癌旁组织miR-590-5p 和miR-590-3p 均同步显著上调。
QPCR结果进一步发现,HepG2、Hep3B、Huh7三株HCC细胞株相对于正常肝细胞株L-O2 miR-590-5p/3p同样表达上调。MTT
和软琼脂克隆形成结果显示,L-O2 分别过表达miR-590-5p 和miR-590-3p,细胞的增殖能力都显著增加（P<0.05）;而HepG2、
Hep3B、Huh7分别下调miR-590-5p和miR-590-3p的表达后,细胞的增殖能力也都显著降低（P<0.05）。Targetscan预测,PDCD4
和PTEN 分别作为miR-590-5p 和miR-590-3p 的潜在靶基因。萤光素酶报告系统以及western blot 结果显示miR-590-5p 和
miR-590-3p 可以分别直接下调靶基因PDCD4 和PTEN的表达（P<0.05）。进一步我们发现miR-590-3p 通过下调PTEN激活
PI3K-AKT信号通路,促进AKT1-S473的磷酸化水平。结论在HCC发展过程中miR-590扮演着重要的致癌因子角色,我们结
果发现miR-590的两个臂都具有促进肿瘤发生的生物学功能,它们分别通过靶向调节抑癌基因PDCD4和PTEN的表达来促进
HCC细胞的增殖和存活,并激活核心的PI3K-AKT肿瘤信号通路。由此可见miR-590 在HCC发生发展过程中具有重要的意
义,也可作为临床诊治潜在的新靶标。
     

宫颈鳞癌组织转移相关基因的初步筛查

目的: 应用基因芯片检测盆腔淋巴结转移组和无转移组宫颈鳞癌组织中差异表达基因,从中筛选肿瘤转移相关基因。方法: 利用基因芯片技术对4例盆腔淋巴结转移组和6例无转移组宫颈鳞癌组织标本进行差异表达基因检测,并用Real-time PCR对部分差异表达基因进行验证。通过基因库检索、PUBMED文献检索和基因本体分析从差异表达基因中筛选肿瘤转移相关基因。结果: 从盆腔淋巴结转移组及无转移组宫颈鳞癌组织中筛选出表达差异明显的基因329个,通过Real-time PCR验证,基因芯片结果可靠。从差异表达基因中筛选出与肿瘤转移相关基因44个。结论: 通过基因芯片筛查,初步建立了宫颈鳞癌转移相关差异基因表达谱,说明宫颈鳞癌的转移过程受多基因调控。     

重症患者全血胶体渗透压影响因素的研究

目的：分析重症患者全血胶体渗透压(colloid osmotic pressure,COP)的影响因素,制定血浆蛋白(plasma
protein,PP)的参考值范围,改良COP的预测公式指导临床实践。方法：收集405例重症患者的一般资料和血气分
析参数,按COP将患者分为A组(COP≤18mmHg)和B组(COP>18mmHg),并监测总蛋白(total protein,TP)、白蛋白
(Albumin,Alb)、球蛋白(Globumin,Glb)和纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)。结果：B组的APACHE II评分显著低于A
组(P<0.05);B组TP,Alb,Glb和FIB水平以及存活率均高于A组(P<0.05);Alb,Glb和FIB的标准化回归系数依次为
0.518,0.283和0.113(P<0.05);B组各类蛋白的95%参考值范围：Alb>23.3 g/L,Glb 12.6~37.6 g/L和FIB 1.3~8.7 g/L,改良
得到预测COP的5个公式。结论：重症患者COP的主要影响因素依次为Alb,Glb和FIB。各类蛋白的参考值范围可指导
蛋白制剂的临床使用,改良公式可以初步预测重症患者的COP。     

大戟根的化学成分分析

目的研究大戟（Euphorbia pekinensis）根的化学成分。方法化学成分分离采用柱层析和液相色谱方法,结构鉴定采用
ESI-MS,NMR。结果从大戟干燥根的乙醇提取物中分离得到4个化合物,分别为地榆皂苷I（1）、3β-α-L-阿拉伯糖基-12,19(29)-
二烯乌苏酸-28-β-D-葡萄糖酯（2）、丹酚酸B（3）和Senarguine B（4）。结论这些化合物均为首次从大戟根中分离得到。
     

熊果酸对大鼠角膜移植排斥反应的抑制作用

目的探讨熊果酸对大鼠角膜移植排斥反应的治疗效果。方法以SD大鼠为供体,Wistar大鼠为受体,将48只Wistar大鼠
随机分为4组。A组为正常角膜对照组,B组为Wistar鼠自体原位角膜移植,C、D 组为SD-Wistar大鼠之间进行同种异体角膜移
植。术后当天腹腔给药,A、B、C三组分别给予生理盐水作为空白对照,D组给予熊果酸（UA）（20 mg·kg-1·d-1）,连续给药12 d。
根据Larkin等角膜排斥反应评分系统,判断术后植片排斥情况。比较角膜植片的存活时间和植片存活率。术后14 d检测各组
中IL-2、IFN-γ、NF-κBp65、VEGF及ICAM-1的表达含量,并对角膜植片进行组织学检查与Western blot分析。结果D组角膜
植片的存括时间为29.12±9.58 d,与C组9.67±2.16 d 相比,两组间差异有显著性意义（P<0.01）。术后14 d D组角膜植片中的
IL-2、IFN-γ、NF-κBp65、ICAM-1及VEGF的相对含量明显下降,而IκB-α蛋白含量较高。未见明显淋巴细胞浸润和新生血管形
成。结论熊果酸作为NF-κB的核因子抑制剂,可以抑制角膜新生血管的形成与排斥反应,从而显著延长大鼠角膜植片的存活
时间。