si-RNA介导FGFR1基因沉默对胃癌细胞生长及凋亡的影响

目的探索靶向沉默成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）表达对胃癌细胞SGC-7901生长及凋亡的影响。方法通过Westernblotting法研究FGFR1蛋白在胃癌细胞SGC-7901以及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的表达情况;设计合成特异性针对FGFR1基因的小干扰RNA（siRNA）及阴性对照-siRNA（NC-siRNA）;采用瞬时转染法将siRNA转入胃癌细胞SGC-7901中,Westernblotting法检测转染siRNA-FGFR1后对SGC-7901细胞中FGFR1蛋白表达的影响。通过MTT法检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞增殖抑制的时间-效应关系,以及克隆集落形成实验检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞克隆集落形成的影响;采用Hoechst染色法和流式细胞术检测siRNA-FGFR1对胃癌细胞凋亡的影响。结果与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901的FGFR1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05）;siRNA-FGFR1转染SGC-7901细胞后,FGFR1蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）;胃癌细胞增殖生长曲线提示,用siRNA技术沉默胃癌细胞中FGFR1的表达后,相较于空白组和NC-siRNA组,siRNA-FGFR1组细胞增殖明显受抑制,另外胃癌细胞SGC-7901克隆集落形成明显受抑制;流式细胞术结果表明,正常组与NC-siRNA组中胃癌SGC-7901细胞早期凋亡百分比差异无统计学意义（P＞0.05）,而siRNA-FGFR1组细胞早期凋亡百分比显著升高（P＜0.01）。结论siRNA-FGFR1可抑制FGFR1蛋白在人胃癌细胞SGC-7901中的表达,并抑制胃癌细胞的生长,促进其凋亡。以FGFR1为靶点的小RNA干扰技术有望成为胃癌靶向治疗的新方法。     

p73β基因转染对胃癌细胞的生物学影响

目的研究人p73β基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的生物学影响,探讨p73β基因抑制SGC-7901细胞增殖的机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SGC-7901细胞,转染重组质粒pcDNA3.1-p73β（SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组）和空载质粒pcDNA3.1-N0（SGC-7901-pcDNA3.1-N0组）,并用未转染质粒具有相同遗传背景和代数的SGC-7901细胞作为空白对照（SGC-7901组）。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中P73β、p21、c-myc表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力,原位细胞凋亡检测TUNEL法观察细胞凋亡。结果RT-PCR检测发现SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞与SGC-7901-pcDNA3.1-N0和SGC-7901两对照组相比,其p73β表达明显增高,p21相对表达量明显增多,c-myc相对表达量明显减少。与两对照组相比,SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞增殖率明显减弱,细胞凋亡率明显增高（均P〈0.05）。结论p73β基因可以促进SGC-7901细胞内p21基因的表达,抑制c-myc基因表达。p73β基因可降低胃癌细胞增殖力,诱导胃癌细胞凋亡。     

siRNA干扰survivin对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的 探讨siRNA沉默survivin基因表达对人胃癌SGC-7901细胞用期、增殖、凋亡的影响及其作用机制的初步探讨.方法 针对survivin mRNA序列设计合成siRNA,转染SGC-7901细胞.MTT法检测SGC-7901细胞增殖;RT-PCR法检测survivin、caspase-3基因表达;Western blot检洲survivin、caspase-3表达;细胞免疫组织化学检测survivin表达;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况.结果 survivin siRNA能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中survivin的表达,与空白对照组比较.survivin siRNA组SGC-7901细胞生长、增殖速度减缓(P＜0.05);survivin在mRNA和蛋白表达水平均显著下调(P＜0.05),caspase-3在mRNA水平变化不明显(P＞0.05),而在蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);survivin siRNA组细胞凋亡率增高(P＜0.05).结论 survivinsiRNA可以下调胃癌SGC-7901细胞survivin基因的表达,抑制细胞的生长活性,并促进其凋亡.     

ALCAM基因1沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的 探讨活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并对其分子机制进行初步研究.方法 将ALCAM 和对照shRNA转染至胃癌细胞SGC-7901中,建立稳定细胞系,分别采用实时荧光定量(RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测转染后SGC-7901细胞中ALCAM mRNA和蛋白水平;采用CCK-8法检测转染后SGC-7901细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测转染后SGC-7901细胞凋亡情况.采用胃癌肿瘤模型分析ALCAM基因沉默对肿瘤生长的影响.结果 ALCAM shRNA稳定细胞系ALCAM mRNA(1.01 ±0.26)和蛋白质的表达水平(1.66 ±0.23)低于对照 shRNA组细胞ALCAM mRNA(0.12 ±0.06)和蛋白质水平(0.23 ±0.09),差异有统计学意义(P<0.05).与对照shRNA稳定细胞系比较,ALCAM shRNA 稳定细胞系细胞增殖活性下降(P<0.05)、凋亡水平升高(P<0.05)、荷瘤小鼠肿瘤生长速度减缓(P<0.05).ALCAM下调并不影响总蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,而降低了AKT和mTOR磷酸化水平,抑制了mTOR活性,此外,ALCAM蛋白敲低提高了Caspase-3蛋白的表达水平,激活了凋亡信号通路.结论 ALCAM基因沉默能够降低胃癌细胞中ALCAM的表达水平,抑制胃癌细胞的增殖,增加细胞凋亡.     

稳定转染靶向bcl-2的shRNA对胃癌SGC-7901细胞株增殖影响

目的 探讨稳定转染靶向bcl-2的小发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响.方法 构建针对bcl-2的shRNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养.RT-PCR方法检测稳定转染后SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响.结果 稳定转染shRNA后,SGC-7901细胞的bcl-2 mRNA表达明显下降;细胞增殖能力及凋亡率无明显变化.结论 稳定转染shRNA能长效抑制SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据.     

siRNA干扰Msi1对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的探讨siRNA沉默Msi1基因表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、侵袭与转移的影响。方法针对Msi1 mRNA序列设计合成siRNA,转染SGC-7901细胞。RT-PCR法检测Msi1基因表达;Westernblot检测survivin、caspase3及MMP-9表达;MTT法检测SGC-7901细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果Msi1 siRNA能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中Msi1的表达,与空白对照组比较,Msi1 siRNA组SGC-7901细胞生长、增殖速度减缓(P<0.05);survivin、MMP9蛋白表达水平显著下调(P<0.05),而caspase3蛋白表达水平上调(P<0.05);Msi1 siRNA组凋亡率增高。结论沉默Msi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、侵袭与转移有负性调节作用。     

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株。方法针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞。RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降,细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。     

HES1对胃癌细胞株增殖､凋亡及迁移能力的影响

目的:探讨siRNA靶向HES1对胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901增殖?凋亡及迁移能力的影响?方法:采用荧光实时定量PCR(qPCR)法检测胃癌组织及胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901的HES1水平,采用脂质体法将2条靶向HES1的siRNA片段(siHES1-1和siHES1-2)高效转染至BGC-823和SGC-7901细胞,经qPCR法检测后选取抑制效率最高的siRNA进行后续功能学研究;分别采用MTT?流式细胞术及Transwell法检测转染后BGC-823和SGC-7901细胞的增殖?凋亡及迁移能力的改变?结果:71例胃癌组织的HES1 mRNA水平高于59例癌旁组织,BGC-823和SGC-7901细胞的HES1 mRNA水平明显高于正常胃黏膜细胞株GES-1(P < 0.05);转染HES1 siRNA可降低BGC-823和SGC-7901细胞的HES1水平,此外,较转染对照组细胞,其存活率及穿膜细胞数目明显降低,凋亡率明显升高(P < 0.05)?结论:胃癌组织及细胞株中的HES1高表达,靶向沉默HES1可抑制胃癌细胞增殖及迁移并诱导细胞凋亡?