渥曼青霉素对脑外伤大鼠自噬及脑保护作用的机制研究

目的探讨渥曼青霉素(wortmannin)在大鼠脑外伤(TBI)引起的损害中发挥的作用及其可能机制。方法①成年雄性Wistar大鼠120只,随机分为3组:假手术组(sham组)、wortmannin组、DMSO组。采用改良自由落体法建立大鼠脑外伤模型,sham组暴露硬脑膜而不撞击,wortmannin组手术前10 min侧脑室注射渥曼青霉素,而DMSO组为手术前10 min注射等量DMSO。②采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白(ATG5,LC3)的表达情况,PI阳性细胞计数法(腹腔注射碘化丙锭PI)观察脑外伤细胞死亡情况。③水迷宫行为学观察大鼠海马学习记忆功能变化。结果①与sham组相比,脑外伤后24 h和48 hDMSO组ATG5、LC3蛋白表达均明显提高,而渥曼青霉素组脑外伤引起的ATG5与LC3上调则被明显抑制。②与sham组相比,脑外伤后24 h和48 h DMSO组的PI阳性细胞数均明显增加(P<0.01),wortmannin组PI阳性细胞数均明显低于DMSO组(P<0.05)。③与sham组相比,DMSO组大鼠找到隐蔽平台的潜伏期均延长(P<0.05);与DMSO组相比,wortmannin组脑外伤后14-17 d大鼠寻找潜伏期的时间明显缩短(P<0.05)。同时,经渥曼青霉素处理的大鼠每天学习的程度更接近假手术大鼠,而DMSO处理的大鼠每天的学习程度较其明显下降(P<0.05)。结论渥曼青霉素能明显抑制脑外伤引起的ATG5与LC3的激活,明显减少脑外伤后PI阳性细胞数,并改善大鼠学习记忆能力,表明渥曼青霉素能减轻脑外伤引起的细胞死亡与神经功能障碍,可能为脑外伤的治疗提供靶点。     

自噬相关机制在颅脑创伤中的研究进展

颅脑创伤（traumatic brain injury,TBI）是世界范围内年轻人和成年人致残的最重要的原因之一。病死率高,而幸存者常伴有身体的残疾、精神障碍等后遗症,为社会发展带来了沉重的负担。自噬是近年来研究的一个热点领域,近年来关于TBI继发性损害机制中自噬的研究逐渐增多,但仍有许多机制有待阐明,本文将从TBI后自噬的变化以及其相关机制进行阐述。     

渥曼青霉素对大鼠脑外伤诱导的凋亡损害的影响

目的探讨渥曼青霉素(wortmannin)对大鼠脑外伤(TBI)模型引起的细胞凋亡的影响及可能机制。方法①健康成年雄性Wistar大鼠100只,随机分为假手术组(sham组)(n=20)、手术对照组(saline组)(n=40)、药物治疗组(wortmannin组)(n=40)。采用改良自由落体法建立大鼠脑外伤模型,sham组暴露硬脑膜而不撞击,wortmannin组打击前左侧脑室注射5μl wortmannin(50 nmol/L),saline组造模前注射5μl生理盐水。②免疫印迹法、Real-time PCR检测脑组织caspase-3、Bax表达情况;DNA凝胶电泳检测脑外伤引起的DNA片段断裂。③图像分析脑体积缺损情况。结果①与sham组相比,saline组脑外伤可明显引起caspase-3、Bax表达增多,Bcl-2表达减少;DNA片段断裂增多,脑体积缺损情况显著。②与saline相比,wortmannin干预能明显抑制caspase-3与Bax的激活(P<0.01),促进Bcl-2表达的增高(P<0.01);抑制脑外伤引起的DNA片段断裂及脑体积缺损(P<0.05)。结论 wortmannin能减轻脑外伤引起的细胞凋亡与脑损害,其机制可能是通过抑制caspase依赖的细胞凋亡途径实现的。     

渥曼青霉素对化疗药物诱导BGC823细胞凋亡的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)对足叶乙甙和阿霉素诱导的人胃癌细胞BGC823凋亡的影响。方法:常规培养人胃癌细胞BGC823,将细胞分为6组:①空白对照组(不加任何药物);②渥曼青霉素组(终浓度为40 nmol/L);③足叶乙甙组(终浓度为20μmol/L);④渥曼青霉素(终浓度为40nmol/L)+足叶乙甙组(终浓度为20μmol/L);⑤阿霉素组(终浓度为0.3μmol/L);⑥渥曼青霉素(终浓度为40nmol/L)+阿霉素组(终浓度为0.3μmol/L)。分别以上述药物干预24 h后,提取各组细胞的蛋白,以NaI法提取各组细胞的DNA。采用DNA琼脂糖凝胶电泳分析各组的细胞凋亡现象,用Western blot检测各组细胞中Caspase-3蛋白的活化表达。结果:DNA琼脂糖凝胶电泳示空白对照组细胞见较弱的DNA梯状谱(DNA Ladder),其他5组细胞均出现明显的DNA梯状谱;阿霉素与足叶乙甙干预后,胃癌细胞BGC823的Caspase-3活性较空白对照组增强,加用渥曼青霉素处理后,Caspase-3活性进一步增强。结论:PI3K抑制剂渥曼青霉素可增强化学治疗药物足叶乙甙和阿霉素对胃癌细胞的凋亡诱导作用,提高其化疗疗效。为寻求新的高效胃癌化疗方案提供理论依据。     

创伤患者外周血单核细胞自噬变化的研究

目的 研究创伤患者外周血单核细胞的自噬变化.方法 ①根据损伤严重度评分(injury severity score,ISS)或简明损伤定级标准(abbreviated injury scale,AIS)将创伤患者分为轻度创伤组、中度创伤组、严重创伤组,同时设立健康对照组,分别于创伤后24 h,3、5、10 d采集外周血,采用密度梯度离心结合贴壁分离法分离创伤患者外周血单核细胞,应用激光共聚焦显微镜和透射电镜观察细胞自噬现象.②将分离得到的单核细胞进行MDC染色并裂解,应用荧光分光光度计(激发光波长380 nm、发射光波长525 nm)测定荧光强度进行定量分析.③于创伤后24 h、3、5 d检测患者血糖水平,分析创伤后自噬与血糖的相关性.结果 与健康对照组相比,创伤患者外周血单核细胞自噬水平明显升高(P＜0.01),创伤后外周血单核细胞自噬水平与创伤程度成正比,与创伤后血糖呈正相关(轻度创伤组:r=0.962,中度创伤组:r=0.928,重度创伤组:r=0.973,P＜0.05).结论 创伤后通过调节单核细胞自噬水平,使机体免疫功能得到恢复,从而改善预后.     

氟尿嘧啶联合渥曼青霉素对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨氟尿嘧啶(Fu)联合渥曼青霉素(wortmannin)对人野生型及突变型p53结肠癌细胞株（HCT-116和SW-480）增殖和凋亡的影响,阐明p53对人结肠癌细胞增殖和凋亡的作用。方法：将处于对数生长期的 HCT-116和SW-480人结肠癌细胞株分为空白对照组、氟尿嘧啶组、氟尿嘧啶联合渥曼青霉素组和氟尿嘧啶联合渥曼青霉素及p53抑制剂（PFT-α）组,分别给予氟尿嘧啶、渥曼青霉素及PFT-α,采用噻唑盐比色法(MTT)、Annexin V-FITC流式细胞术（FCM）检测各组细胞12、24和48 h的存活率和细胞凋亡率。结果：与氟尿嘧啶组比较,渥曼青霉素联合氟尿嘧啶组HCT-116和SW-480细胞存活率显著降低（P<0.05）,并随时间延长而逐渐降低;流式细胞术（FCM）检测,各组细胞凋亡率随时间的延长而增高（P<0.05）;与渥曼青霉素联合氟尿嘧啶组比较,氟尿嘧啶联合渥曼青霉素及PFT-α组HCT-116细胞存活率及细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）,而SW-480细胞48 h的存活率显著降低（P<0.05）,凋亡率显著增高（P<0.05）。结论：渥曼青霉素能显著增强氟尿嘧啶对人结肠癌细胞增殖的抑制作用并促进结肠癌细胞凋亡;抑制p53表达能进一步增强渥曼青霉素联合氟尿嘧啶对p53突变型SW-480细胞增殖的抑制作用并促进细胞凋亡。
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Rho激酶和自噬在法舒地尔抗心肌缺血/再灌注损伤中的作用

目的探讨自噬在法舒地尔（Fasudil）抑制Rho激酶心肌保护中的变化,并分析其作用及可能机制。方法离体大鼠心脏 Langendorff装置灌流,结扎冠状动脉左前降支30 min模拟局部心肌缺血,松开结扎线恢复灌流120 min复制心肌缺血/再灌注 （ischemia/reperfusion, I/R）模型。实验分3组：I/R组、法舒地尔（Fasudil）组、和Fasudil+自噬抑制剂渥曼青霉素（Wort）组。连续 记录左心室动力学变化,收集再灌注5、10 min冠脉流出液测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量;RT-PCR检测自噬 相关基因Atg5、Beclin1和凋亡相关基因Bax、Bcl-2 mRNA表达的变化,Western blotting检测caspase 3的表达变化。结果与I/ R组比,Fasudil使左心室发展压、左心室内压最大上升及下降速率、左心室做功明显得到改善,降低复灌期冠脉流出液中LDH 的释放,Atg5、Beclin1 mRNA表达增加,Bcl-2/Bax mRNA升高,caspase 3蛋白表达降低。自噬抑制剂Wort减弱了法舒地尔的 保护作用,抑制了心室动力学指标的恢复,LDH释放增多,Atg5和Beclin1 mRNA表达降低,Bcl-2/Bax降低,caspase 3蛋白表达 升高。结论抑制Rho激酶心肌保护作用中诱导了自噬的发生,且自噬起到保护心肌的作用,可能与减少细胞凋亡有关。     

右美托咪定对渥曼青霉素引起的海马CA1区神经元凋亡的影响

目的探讨右美托咪定(Dex)对渥曼青霉素(Wort)引起的海马CA1区神经元凋亡的影响。方法以SD大鼠胎鼠海马CA1区神经元为研究对象,(1)Wort对海马CA1区神经元的致凋亡作用:将SD大鼠海马CA1区神经元随机分为4组,对照组及Wort不同剂量组(Wort 0.3、1.0、3.0组),对照组不作处理,Wort 0.3、1.0、3.0组分别接受0.3、1.0、3.0μmol/L Wort处理24 h;(2)Dex的抗凋亡作用:将SD大鼠海马CA1区神经元随机分为5组,对照区(不作处理)、Wort组(3μmol/L Wort处理24 h)、Wort+Dex 0.1组(3μmol/L Wort+0.1μmol/L Dex处理24 h),Wort+Dex 1.0组(3μmol/L Wort+1.0μmol/L Dex处理24 h)和Wort+Dex 10.0组(3μmol/L Wort+10.0μmol/L右美托米啶处理24 h)。采用DAPI荧光染色法法计数细胞凋亡数,计算凋亡率。结果 3个剂量的Wort均可引起海马CA1区神经元凋亡,以Wort 3.0组最为明显;Wort+Dex 0.1、1.0、10.0组与Wort组比较细胞凋亡率明显下降(P<0.05,P<0.01),但仍明显高于对照组(P<0.01)。结论 Dex能有效抑制Wort引起的海马CA1区神经元凋亡,具有神经保护作用。     

渥曼青霉素联合丝裂霉素对人肝癌HepG-2细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究渥曼青霉素(Wortmannin)联合丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)对肝癌HepG-2细胞增殖、凋亡及相关基因 Cyclin D1、Bad表达的影响.方法 实验分4组,对照组:未处理的HepG-2细胞;Wortmannin组:用终浓度为25、50、100、200、400 nmol/L Wortmannin处理的HepG-2细胞;MMC组:用终浓度为1.875、3.75、7.5、15、30 nmol/L MMC处理的HepG-2细胞;联合用药组:同时用Wortmannin和MMC处理HepG-2细胞,终浓度为26.875、53.75、107.5、215、430 nmol/L. MTT比色法检测细胞增殖状态;Hoechst 33258荧光染色观察凋亡细胞核形态学变化,流式细胞术检测肿瘤细胞周期和凋亡;逆转录聚合酶联反应及Western blot检测PI3K/Akt信号传导通路相关基因和蛋白的表达.结果 联合用药组的细胞增殖抑制率显著高于单独用药组(P<0.05);联合用药作用24 h后流式细胞术显示细胞明显阻滞于G0/G1期;细胞凋亡率由处理前的(3.23±1.32)%提高到(14.82±1.36)%(P<0.01);荧光显微镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变;联合用药后细胞p-Akt活化程度降低,Cyclin D1表达量减少,Bad表达量增加(P<0.05).结论 渥曼青霉素与丝裂霉素联合应用,具有协同抗肿瘤效应.     

兔颅脑创伤后血清抗脑抗体变化及脑组织谷氨酸的表达

目的：研究家兔颅脑创伤后抗脑抗体的变化及脑组织谷氨酸的表达。方法：16只成年新西兰白兔分为两组,颅脑创伤组（n=8）、假手术对照组（n=8）,建立兔脑单侧重型液压冲击创伤模型,收集所有家兔创伤前2h及创伤后3、7、14、21、28、35、42、49d各时间点血清标本。用ELISA法检测血清抗脑抗体的浓度：用免疫组化方法检测脑组织谷氨酸（Glu）的表达。结果：在予以单侧液压打击后,颅脑创伤组家兔血清中抗脑抗体浓度增高并有峰值出现,假手术对照组抗脑抗体浓度变化则不明显,两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;颅脑创伤组家兔脑组织Glu的表达较假手术组增高,两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：颅脑创伤后,血清中抗脑抗体与伤前相比有明显升高;颅脑创伤后脑组织Glu的表达增高,提示抗脑抗体可能是颅脑创伤后出现癫痫的原因之一。     

Nrf2通路在创伤性脑损伤中保护作用的研究进展

在氧化应激状态下,转录因子Nrf2从细胞质转移入细胞核,与抗氧化反应元件结合调节多种保护性细胞因子表达,从而增强细胞对氧化应激的抵抗能力。研究表明,Nrf2通路在创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后激活,抑制继发性脑损伤而发挥脑保护作用。而Nrf2基因敲除小鼠比野生型小鼠在TBI后炎性细胞因子表达增强,抗氧化和解毒酶活力下降,神经元钙超载、凋亡及脑水肿加重,神经功能缺失加重。以上研究提示,Nrf2通路在TBI中具有脑保护作用,另外,该通路还具有对TBI后继发性急性肺损伤、肠道屏障功能破坏的保护作用。Nrf2激活剂能减轻TBI后继发性脑损伤、维持血脑屏障功能、减轻脑水肿而发挥保护作用。     

大鼠创伤性脑损伤后胰岛素抵抗的研究

目的:探讨大鼠创伤性脑损伤后是否存在胰岛素抵抗现象.方法:采用大鼠自由落体脑损伤模型(Feeney'smodel),分别在伤前1/2h及伤后6、12、24、48、72、120h测定轻、中、重型脑损伤动物的血糖和血清胰岛素值.运用正常血糖-高血胰岛素钳夹技术,检测大鼠重型创伤性脑损伤后24h后BG60-120、GIR60-120、ISI等3个反映胰岛素敏感性的指标.结果:中、重型创伤性脑损伤后大鼠血糖含量升高的同时血清胰岛素水平升高,大鼠重型创伤性脑损伤后24hBG60-120显著地升高,GIR60-120、ISI显著地降低.结论:在重型创伤性脑损伤急性期,大鼠血糖和血清胰岛素水平均显著地升高,高水平的胰岛素未能起到相应的降低血糖的作用,与机体产生胰岛素抵抗有关.     

生酮饮食在创伤性颅脑损伤中神经保护作用研究

目的生酮饮食主要用于治疗癫痫,已证实它对多种神经系统疾病具有神经保护作用,但对创伤性颅脑损伤相关作用研究甚少。文中旨在探讨生酮饮食在创伤性颅脑损伤后的抗氧化神经保护作用。方法采用出生35 d的SD大鼠,建立自由落体创伤性颅脑损伤模型,分别给予生酮饮食、正常饮食1周,然后处死测脑组织干湿重比,用Western blot和RT-PCR测血红素氧合酶1(Hemeoxygenase 1,HO-1)蛋白及基因水平。结果给予生酮饮食后,脑水肿减轻,HO-1 mRNA的表达及蛋白含量均增高。结论生酮饮食对颅脑损伤患者具有抗氧化神经保护作用。     

谷氨酸受体-2在闭合性颅脑损伤中的表达

【目的】研究闭合性脑损伤后GluR2在脑组织中的表达部位、时序性特点【方法】采用清洁级SD大鼠随机分为对照组及损伤后1 h组、2 h组、4 h组、8 h组、12 h组、24 h组、2 d组、3 d组、5 d组、7 d组,复制marmarou＇s落体打击脑损伤模型。免疫组化SP法检测SD大鼠脑组织GluR2的表达情况。采用Mias 2000图像分析系统采集并计算阳性细胞数和阳性细胞面积。以P〈0.05为显著性差异的水准。【结果】对照组顶叶皮层、海马等部位均有免疫反应阳性细胞表达。损伤后阳性细胞表达减少,12~24 h达最低值,顶叶皮层、海马CA4、CA3、脑底皮层阳性细胞面积、阳性细胞计数与对照组比较差别有极显著意义（P〈0.01）【结论】脑损伤后,GluR2表达逐渐减少,提示其参与颅脑损伤病理生理过程。     

大鼠创伤性脑损伤后血糖与血清胰岛素变化规律的研究

目的：研究大鼠创伤性脑损伤后血糖与血清胰岛素的变化规律。方法：采用大鼠自由落体脑损伤模型(Feeney’s model)，分别在伤前1／2h及伤后6、12、24、48、72、120h测定各组动物的血糖和血清胰岛素值。结果：大鼠创伤性脑损伤后血糖升高。脑损伤程度越重，血糖升高的速度越快，峰值越高。轻型脑损伤后血清胰岛素变化不明显。中、重型脑损伤后血清胰岛素水平升高，而且脑损伤越重，血清胰岛素含量升高的速度越快，峰值越高，但血清胰岛素水平下降的时间越早，至伤后72h血清胰岛素水平有低于伤前水平的趋势。结论：创伤性脑损伤后血糖升高可能与多种升血糖激素(如肾上腺素、胰高血糖索、糖皮质激素、生长激素等)和降血糖激素(如血清胰岛素)之间的动态变化及机体存在胰岛素抵抗有关。     

颅脑损伤后继发肾上腺皮质功能不全的临床研究

目的 研究各型颅脑损伤后肾上腺皮质功能不全（Al）发生情况.方法 分析48例颅脑损伤患者受伤后72h早晨8时的基础皮质醇水平;同时应用小剂量ACTH刺激实验,检测刺激后30、60min的皮质醇水平,确定Al发生情况.结果 轻型、中型、重型颅脑损伤的皮质醇浓度分别为（660.57 ±233.66）、（675.46±326.1）、1625.05±316.6）nmol/L.3组间的差异无统计学意义（P〉0.05）.Al发生率分别为0%（0/8）、17.6%（3/17）、43.5%（10/23）,3组间的差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 颅脑损伤后基础皮质醇水平不能反应肾上腺皮质功能不全;Al在重型颅脑损伤中发生率较高.     

Inhibitory effect of progesterone on inflammatory factors after experimental traumatic brain injury

Objective Traumatic brain injury (TBI) is one of the leading causes of morbidity and mortality in young people. Inflammatory cytokines play an important part in the pathophysiology of TBI. Recent studies demonstrate that progesterone significantly reduces cerebral edema and enhances functional recovery from TBI and stroke in several animal models. This study was designed to investigate the inhibitory effect of progesterone on inflammatory response after traumatic brain injury. Methods Progesterone was injected intraperitoneally using rats as a model of traumatic brain injury, and Western blot technique was applied to detect the expression of three inflammation-related factors: nuclear factor kappa B p65 (NFκB p65), glial fibrillary acidic protein (GFAP), and tumor necrosis factor-α (TNF-α). The water content of injured brain was also examined. A neurological severity score was recorded to evaluate the effect of progesterone on neurodeficit recovery. Results NFκB p65, GFAP, and TNF-α were increased in all injured animals. In rats treated with progesterone, the expression level of NFκB p65 and TNF-α were reduced significantly in comparison with vehicle-treated rats. However, progesterone did not alter the expression of GFAP in the injured rats. Progesterone also reduced the water content of injured brain and the lesion volume. In addition, progesterone-treated injured rats showed significant improvements in the Neurological Severity Score test, compared with vehicle-treated ones. Conclusions Progesterone inhibits the inflammatory response after experimental traumatic brain injury and mitigates the severity of brain damage.     

叔丁基对苯二酚预处理对大鼠创伤性脑损伤的保护作用研究

目的氧化应激是创伤性颅脑损伤后重要继发性病理生理反应,新近研究发现,Nrf2-ARE信号路径具有抗氧化作用。文中拟验证Nrf2诱导剂叔丁基对苯二酚(tertiary buty lhydroquinone,t-BHQ)预处理对创伤性脑损伤后大鼠的脑保护作用。方法将54只SD大鼠随机分为对照组、损伤组和给药组,每组18只。给药组大鼠颅脑创伤前24h腹腔预注射t-BHQ,采用改良的Feeney′s自由落体方法制作颅脑外伤模型,伤后24h应用干湿重比方法测定各组大鼠局部损伤脑组织含水量、应用原位末端标记法(terminal deoxynudeotidyl transferase mediated duTP nick end labeling assay,TUNEL)检测细胞凋亡。结果t-BHQ可降低大鼠脑损伤后脑皮质含水量,病理学检查结果也证实,t-BHQ预处理可显著减轻损伤神经元的凋亡指数。结论t-BHQ预处理可有效地保护创伤性脑损伤后大鼠损伤脑组织。     

大鼠脑创伤后Bax蛋白表达与神经细胞凋亡

①目的 探讨颅脑创伤后神经细胞凋亡的机制。②方法 采用重型闭合性颅脑创伤模型，将Wistar大鼠204只，随机分为脑创伤组及假手术组，每组又分别划分成伤后3、6、12、24、48、72、168及336小时等8个时相组，每时相组各12只．另12只作为正常时照组。采用免疲组织化学及原位细胞凋亡检测，动态观察大鼠颅脑创伤后皮质、海马、丘脑及齿状回区神经细胞凋亡和Bax蛋白的表达情况。③结果 脑创伤后皮质、海马、丘脑及齿状回区出现神经细胞凋亡，皮质、海马及丘脑出现Bax蛋白表达增加．而齿状回在各时相点均无Bax蛋白表达。④结论 大鼠颅脑创伤后皮质、海马、丘脑及齿状回出现神经细胞凋亡；Bax蛋白表达增加可能参与了脑创伤后皮质、海马及丘脑神经细胞凋亡，而不参与齿状回区的神经细胞凋亡。     

硫酸镁对大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的影响

目的:观察创伤性颅脑损伤(TBI)后大鼠神经细胞凋亡现象.应用硫酸镁观察其对损伤后大鼠神经细胞凋亡的影响.方法:采用Feeney损伤模型,运用原位末端标记(Tunel)技术,观察中度脑损伤后2h～5d伤侧大脑皮层、海马神经细胞凋亡情况,结果:1.Tunel染色:伤侧大脑半球广泛存在细胞凋亡,以受伤区周缘为甚,伤后2h即可见凋亡细胞,2～3d达高峰,5d时减少.2硫酸镁治疗后8h～3d,伤侧皮层、海马区细胞凋亡数与损伤组比较明显减少(P＜0.05).结论:TBI后,神经元发生变性、坏死的同时,存在凋亡现象.硫酸镁能阻滞TBI后神经细胞的凋亡,具有脑保护作用.