高浓度唑来膦酸对人成骨细胞成骨分化及凋亡影响的实验研究

目的研究高浓度唑来膦酸对体外分离的健康人下颌骨成骨细胞的影响。方法体外分离培养来源于健康人下颌骨的成骨细胞,取P3代成骨细胞,用1 μmol/L、5 μmol/L唑来膦酸分别处理,不加药组为空白对照。以CCK8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,ALP染色及定量分析检测细胞成骨分化,荧光定量PCR检测成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达,Western免疫印迹检测OPN蛋白的表达。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果唑来膦酸处理后的成骨细胞增殖减慢,5 μmol/L处理组较1 μmol/L组增殖更慢。药物处理后的细胞凋亡较对照组增加,且随着药物浓度的增加,凋亡百分比显著上升。1 μmol/L及5 μmol/L唑来膦酸处理后的成骨细胞的成骨分化能力较对照组显著下降。荧光定量PCR结果提示,药物处理后的成骨相关基因ALP、OPN和Runx2的表达显著降低。Western免疫印迹检测结果显示药物处理组OPN蛋白表达量显著下降。结论高浓度唑来膦酸抑制来源于人下颌骨成骨细胞的增殖及成骨分化,促进其凋亡发生。     

水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的效应

目的 探讨水解罗非鱼胶原促进人牙周膜细胞活力及成骨分化的作用。方法 制备水解罗非鱼胶原,原代分离培养人牙周膜细胞（hPDL细胞）,分别利用MTT试验和real-time PCR试验检测水解罗非鱼胶原对细胞活力和成骨分化相关基因ALP,COL I,OCN和RUNX2的表达的影响,运用激光共聚焦显微镜观察成骨分化相关蛋白骨钙蛋白的表达,进一步采用western blot技术探讨水解罗非鱼胶原对整合素-ERK信号通路的作用。结果 水解罗非鱼胶原能促进hPDL细胞的增殖,使ALP,COL I,OCN和RUNX2的基因上调,诱导骨钙蛋白的产生,这些生物效应与水解罗非鱼胶原可激活整合素-ERK信号通路有关。结论 水解罗非鱼胶原具有骨诱导性,具有诱导hPDL细胞成骨分化的潜能。     

高浓度唑来膦酸对人牙周膜干细胞凋亡及成骨分化影响的实验研究

目的：研究高浓度唑来膦酸对体外分离的健康人牙周膜干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响。方法：体外分离培养健康人牙周膜干细胞,用不同浓度的唑来膦酸（5μmol/L、10 μmol/L）处理,不加药组为空白对照。 以 CCK8 检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡,ALP、茜素红染色及半定量分析检测细胞体外成骨分化,荧光定量PCR检测成?标志物I型胶原(COL1A1)和骨钙素（OCN）基因的表达,免疫荧光检测 OCN和 COL1A1 蛋白的表达。结果： 唑来膦酸可呈计量依赖性抑制人牙周膜干细胞增殖;唑来膦酸用药组细胞的凋亡率显著?于对照组,且随着药物浓度的增加,凋亡百分比逐渐上升;ALP和茜素红染?结果表示唑来膦酸用药组细胞的体外成骨分化能力较对照组显著下降;荧光定量PCR和免疫荧光结果提示,药物处理后OCN和 COL1A1的基因表达和蛋白表达均降低。结论：高浓度唑来膦酸显著抑制人牙周膜干细胞的增殖及体内外成骨分化,并诱导其凋亡。     

水解鱼胶原诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用

目的 探讨水解鱼胶原诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)成骨分化的潜能.方法 制备获得水解鱼胶原,对其分子量,氨基酸成分和接触角进行表征,利用MTT 试验和Real-Time PCR 试验分别研究水解鱼胶原对rBMSCs 细胞活力及成骨分化相关基因ALP,OCN 和RUNX2 的影响,利用western blot 技术探讨水解鱼胶原对ERK1/2 信号通路的影响. 结果 水解鱼胶原的分子量为700-1300 Da,接触角约为26 度,主要含甘氨酸,脯氨酸和羟脯氨酸.水解鱼胶原能提高rBMSCs 细胞的活力,促进成骨分化相关基因ALP,OCN 和RUNX2 的表达,Western Blot 结果显示水解鱼胶原可激活ERK1/2 信号通路,进而促进RUNX2 蛋白表达上调. 结论 水解鱼胶原具有诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能.     

促红细胞生成素在成骨细胞分化中的实验研究

目的 研究促红细胞生成素(EPO)对成骨细胞分化和功能的影响以及EPO-EPO受体(EPOR)信号在成骨细胞中的作用,探讨EPO在骨稳态中的作用及其机制.方法 体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2),加入EPO蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链式反应方法检测成骨分化相关基因的变化,采用碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色方法观察成骨细胞骨形成功能.采用RNA干扰技术沉默EPOR基因,检测阻断EPO-EPOR信号通路后成骨细胞分化和功能的变化.结果 骨髓基质细胞表达EPOR,EPO与受体EPOR结合后,可诱导其向成骨细胞分化,增加Runx2、Alp和Coll等成骨细胞相关基因的表达,同时增加ALP蛋白的表达和钙结节的沉积.EPOR基因沉默后,成骨相关基因的表达受到抑制.结论 EPO通过EPOR信号促进成骨细胞的分化和功能.     

Foxc2稳定转染对C3H10T1/2细胞成骨性能的影响

目的:探讨Foxc2基因过表达对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞系C3H10T1/2细胞生物学行为及分化能力的影响.方法:通过慢病毒转染构建Foxc2过表达C3H1OT1/2细胞系,采用实时定量PCR和Western免疫印迹法检测转染后Foxc2蛋白的表达.应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,实时定量PCR和Western免疫印迹法检测过表达Foxc2对成骨、成脂相关基因(Runx2、OPN、OCN、PPARγ)表达的影响,分别通过碱性磷酸酶(ALP)染色和油红染色检测细胞成骨和成脂分化能力.采用SPSS 17.0软件包对数据进行t检验.结果:成功构建Foxc2稳定过表达的C3H10T1/2细胞系,发现Foxc2过表达阻滞细胞于G1期,抑制细胞增殖.在成骨诱导过程中,过表达Foxc2可以显著上调Runx2、OPN、OCN等成骨相关基因的表达.ALP染色显示,Foxc2稳定过表达细胞较对照组细胞染色深.在成脂诱导过程中,过表达Foxc2显著下调PPARγ基因的表达;油红染色显示,成脂分化进程被部分抑制.结论:Foxc2过表达抑制细胞增殖,促进细胞分化.其机制是上调Runx2、OPN、OCN成骨相关基因的表达,下调PPARγ的表达,促进C3H10T1/2细胞的成骨分化,抑制其成脂分化.     

牛血浆纤维黏连蛋白对大鼠成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响

目的:研究外源性纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)对大鼠成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,探讨应用FN治疗骨缺损性疾病的可行性。方法:酶消化法分离成骨细胞,通过细胞对染料Alamar蓝摄取检测细胞增殖,ELISA方法检测碱性磷酸酶活性,流式细胞术检测FN对成骨细胞细胞周期及凋亡的影响,Western印迹法检测FN作用后成骨细胞Bcl-2及Bax基因的蛋白表达变化。采用SPSS12.0软件包对实验数据进行单因素方差分析。结果:FN浓度为40μg/mL以上时,能促进大鼠成骨细胞的增殖,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);FN能增加成骨细胞ALP活性,各组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),并有明显的剂量依赖性;不同浓度的FN作用成骨细胞后,可使处于DNA合成期(S期)的细胞百分率增加;增殖指数(proliferation index,PI)增加,细胞凋亡百分率减少,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);FN作用后的细胞,Bcl-2基因的蛋白表达量增加,Bax基因的蛋白表达量减少,有剂量依赖性。结论:外源性FN能促进大鼠成骨细胞增殖、分化,使大鼠成骨细胞的DNA合成期(S期)的细胞百分比增加,同时抑制大鼠成骨细胞的凋亡,使大鼠成骨细胞胞质内Bcl-2基因的蛋白表达量增加,同时减少Bax基因的蛋白表达量。     

促红细胞生成素促进骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的:研究促红细胞生成素(EPO)通过ephrinB2/EphB4信号通路在细胞成骨分化中的作用。探讨EPO在骨稳态中的作用及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2),加入EPO后,采用real-time PCR方法检测EphB4的表达以及成骨细胞相关基因的表达,采用ALP活性检测和茜素红染色观察EPO对成骨细胞功能的影响;在体外培养的ST2细胞中加入ephrinB2-Fc蛋白,模拟破骨细胞-成骨细胞共培养,使ephrinB-EphB4正向信号激活,采用上述方法检测其对成骨细胞的影响;进一步采用RNAi技术,使EphB4基因沉默,检测EPO对成骨细胞的影响。结果:EPO能增加ST2细胞RUNX2、ALP和Col1等成骨细胞相关基因的表达,同时伴随ST2细胞表面EphB4的表达升高,ALP活性和钙结节也增加;在模拟破骨细胞-成骨细胞共培养体系中,EPO也能促进ST2细胞的成骨向分化和功能;EphB4基因沉默后,EPO对ST2细胞的作用被减弱。结论:EPO能促进成骨细胞的分化和功能,该作用是通过ephrinB2/EphB4信号介导的。     

硝苯地平作用下miR-4651对牙龈间充质干细胞成骨分化功能的影响

目的 研究miR-4651在硝苯地平作用下对牙龈间充质干细胞(GMSCs)成骨分化的影响。方法 利用miR-4651mimics及miR-4651inhibitor在GMSCs进行丧失性及获得性功能研究。定量RT-PCR检测miR-4651表达,碱性磷酸酶活性(ALP)测定、茜素红染色、钙离子定量以及定量RT-PCR检测牙龈间充质干细胞成骨/成牙本质分化相关基因的表达。结果 过表达miR-4651能明显促进牙龈间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨/成牙本质分化相关基因的表达。敲减miR-4651能明显抑制牙龈间充质干细胞ALP活性、体外矿化能力及成骨/成牙本质分化相关基因的表达。在1μg/ml硝苯地平作用下,过表达miR-4651同样能促进牙龈间充质干细胞骨向分化。1μg/ml硝苯地平作用下,敲减miR-4651同样是抑制牙龈间充质干细胞的骨向分化。结论 即使在一定量硝苯地平作用下,miR-4651仍可促进牙龈间充质干细胞的成骨分化。     

大鼠髁状突发育和软骨细胞凋亡的研究

目的研究大鼠髁状突形成和发育过程,以及凋亡相关因子(Fas)和一氧化氮(NO)凋亡途径在其发育中作用。方法收集胎鼠及幼鼠的颞下颌关节标本,通过苏木精-伊红染色、原位末端脱氧核糖昔酞转移酶分析法(TUNEL)和Fas及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)免疫组化检测髁状突发育特征。结果胚胎15.5d时髁状突和关节窝已基本出现,胚胎17.5d时髁状突出现完整的软骨细胞分层和软骨内成骨,胚胎19.5d时出现清晰的关节盘,各期均可见凋亡的软骨细胞,凋亡细胞在关节软骨表层细胞中所占比例高于深层细胞,Fas阳性细胞分布大致同凋亡细胞,而iNOS阳性细胞较少,主要分布在肥大层。结论髁状突的发育与软骨细胞凋亡密切相关,Fas和NO凋亡途径在其发育中均起到一定作用。     

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目的    探讨吸烟对牙龈上皮棘层细胞凋亡的影响及可能的机制。方法    本研究于2004年12月至2010年12月在济南市口腔医院和山东大学口腔医院进行。选取52例具有不同吸烟史、无严重系统疾病且行牙冠延长术或智齿拔除术的患者，根据吸烟史、日平均吸烟支数和总吸烟支数将患者分为轻度吸烟组（吸烟史＜5年或日平均吸烟≥2～10支，且总吸烟支数约1.5万支以下）21例、重度吸烟组（吸烟史≥5年或日平均吸烟≥10支，且总吸烟支数约1.5万支以上）31例。另取无吸烟史的10例患者作为对照组。采用原位末端标记（ TdT-mediated- dUTP nick end labeling， TUNEL） 法检测各组患者牙龈上皮棘层细胞的凋亡情况；Student-Newman-Keuls（SNK）法计算各吸烟组与对照组及各吸烟组之间的差异，取α=0.05水准；PV免疫组化法对凋亡抑制基因Bcl-2的表达进行组织定位。结果    各吸烟组患者牙龈上皮棘层细胞凋亡阳性的表达与对照组患者间差异均有统计学意义（P＜0.01）；轻度吸烟组和重度吸烟组患者间差异也有统计学意义（P＜0. 01）。Bcl-2在吸烟者牙龈上皮的基底层和棘层表达较对照组减弱。结论    吸烟可能通过降低促Bcl-2的表达，促进牙龈上皮棘层细胞凋亡的发生，干扰牙龈上皮的正常代谢。     

机械应力对大鼠成肌细胞凋亡的影响

目的：探讨周期性张应力对大鼠成肌细胞凋亡的影响及Caspase-3凋亡通路在此过程中的作用。方法：采用细胞体外加力装置将不同强度的周期性牵张力施加于体外培养的大鼠成肌细胞,24h后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞计数,统计学分析,Western-blot检测各组细胞内Caspase-3表达变化。同时采用Caspase-3抑制剂对照检测,进一步明确Caspase-3的具体作用。结果：随周期性牵张力强度的增加,细胞凋亡比例也随之增加,当牵张力达到20%细胞表面拉伸率时,凋亡细胞比例由不加力时的4.18%增加到7.78%,细胞内Caspase-3含量也呈强度依赖性升高,相对OD值由0.027增加到0.081,这一凋亡过程可被Caspase-3的抑制剂所阻断。结论：周期性张应力可以导致大鼠成肌细胞凋亡,并呈强度依赖性,该过程是由Caspase-3凋亡通路介导的。     

高压氧对糖尿病型牙周炎牙龈细胞凋亡及凋亡因子表达的调控作用研究

目的 探讨高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)对糖尿病型牙周炎（diabetes associated periodontitis, DAP）牙龈组织细胞凋亡及凋亡因子表达的调控作用及机制。方法 选择DAP患者60例,其中20例予以0.25 MPa HBO治疗2周,20例予以牙周洁治和根面平整（scaling and root planning, SRP）治疗,20例予以HBO+SRP治疗,在治疗前和治疗后1个月测定PLI、SBI、GI、PD、AL,用HE染色、TUNNEL染色和透射电镜观察牙龈细胞凋亡,免疫组化（IHC）检测牙龈组织IL 1β、TNF α、PGE2、Caspase3表达。结果 治疗后1个月时HBO组、SRP组、HBO+SRP组SBI、GI、PD比治疗前明显降低;牙龈上皮层和固有层细胞凋亡数量和凋亡细胞阳性表达指数明显降低,牙龈组织IL 1β、TNF α、PGE2及Caspase3表达明显降低。治疗后1个月时HBO+SRP组SBI、GI、PD、AL及牙龈细胞凋亡指数与HBO组和SRP组相比均有显著性差异;牙龈组织IL 1β、TNF α、PGE2、Caspase3表达比HBO组和SRP组降低。IL 1β、TNF α、PGE2主要阳性细胞为巨噬细胞和淋巴细胞,Caspase3 阳性细胞为上皮基底细胞、棘细胞。结论 HBO可显著降低DAP患者牙龈组织中IL 1β、TNF α、PGE2含量,减少牙龈组织中Caspase3表达,抑制细胞凋亡,HBO联合SRP疗效更好,可维持1个月以上。     

口腔癌前病变细胞凋亡的原位观察与分析

目的　探讨口腔白斑、扁平苔藓的癌变机制。方法　通过原位末端转移酶标记法 ,观察分析 10例正常口腔黏膜上皮 ,18例扁平苔藓 ,2 3例白斑 ,2 2例鳞癌上皮组织凋亡状况。结果　除单纯上皮增生 ,非糜烂型扁平苔藓外 ,上皮 (轻、中、重 )异常增生 ,鳞癌及糜烂型扁平苔藓的凋亡指数均高于正常 ,差异有显著性。从上皮异常增生到鳞癌凋亡指数逐渐增高 ,糜烂型扁平苔藓的凋亡指数低于鳞癌 ,差异有显著性。结论　细胞凋亡参与白斑癌变的过程 ,在病变不同阶段作用不同。扁平苔藓的发病机制可能与细胞免疫诱导角朊细胞凋亡亢进有关     

Effects of nicotine on apoptosis in human gingival fibroblasts

Aim

Cigarette smoke is a complex mixture of more than 4700 chemical compounds including free radicals and oxidants and it is a world widely known problem to health. Nicotine is the major compound of tobacco and known as the cause of gingivitis and periodontitis. It induces intracellular oxidative stress recognized as the important agent in the damage of biological molecules. The aim of this study is to clarify the cytotoxic pathway of nicotine in human gingival fibroblasts (HGFs).

Methods

Human gingival fibroblasts stimulated by nicotine were used as an in vitro model. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to detect cell viability and reactive oxygen species (ROS) generation was assessed with 2,7-dichlorofluoroscein diacetate (DCF-DA). Morphological change was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labelling (TUNEL) assay, stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). To delineate the roles of extracellular signal-regulated kinase (ERK), P38 and c-Jun N-terminal kinase (JNK), Western blot and caspase-3 (CASP3) activity assay were performed.

Results

Exposure of the human gingival fibroblasts to nicotine reduced cell viability by time and dose dependent and increased the generation of ROS. It also showed morphological evidence of increased apoptosis, resulted in transient activation of JNK and ERK concomitant with activation of P38, and stimulated apoptosis as evidenced by CASP3 activation and Poly ADP ribose polymerase (PARP) cleavage.

Conclusion

These results suggest that nicotine induces apoptosis through the ROS generation and CASP3 dependent pathways in HGFs.     

Bcl-2和Bax在牵张应变诱导HPDLCs凋亡中的表达研究

目的：研究牵张应变诱导人牙周膜细胞（HPDLCs）凋亡过程中细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化情况。方法：体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载20%动态牵张应变24h,通过real-time PCR检测Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达差异。结果：HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。Bcl-2和Bax基因表达显著增加,Bcl-2/Bax比值显著下降,有明显统计学意义（P〈0.05）。结论：牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中,Bcl-2家族起到了重要作用。     

吸烟对牙龈上皮细胞凋亡的影响

目的:观察不同程度吸烟患者的牙龈上皮棘层和基底层细胞凋亡的情况,评价吸烟对牙龈上皮细胞正常代谢和蛋白质分泌的影响。方法:选取47例具有不同吸烟史、无严重系统疾病且行牙冠延长术或智牙拔除术的患者为研究对象,男41例,女6例,年龄18～29岁(平均年龄21.4岁),根据吸烟史、日平均吸烟支数和总吸烟支数,将患者分为Ⅰ(轻)度(吸烟史<5a,或2≤日均支数<10且总支数约1.5万支以下)19例,Ⅱ(重)度(5a≤吸烟史,或10≤日均支数且总支数约1.5万支以上)28例。另取无吸烟史的10例患者作为对照组。采用原位末端标记(TdT-mediated-dUTPnickendlabeling,TUNEL)法检测牙龈上皮棘层和基底层细胞的凋亡情况。采用Newman-Keuls法比较各吸烟组之间及其与对照组间的差异,取α=0.05水准。结果:吸烟者的牙龈上皮棘层和基底层细胞凋亡阳性的表达高于未吸烟者,且棘层(P<0.01)改变较基底层(P<0.05)明显。轻度吸烟组和重度吸烟组之间也存在显著性差异(P<0.05、P<0.01)。结论:吸烟对牙龈上皮棘层的凋亡具有明显的促进作用,从而干预上皮细胞的正常蛋白分泌和代谢。     

转染骨形成蛋白2基因对细胞凋亡影响的实验观察

目的：探讨骨形成蛋白（ＢＭＰ）与细胞凋亡的关系及意义。方法：利用脂质体转染方法将ＢＭＰ２真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得阳性细胞克隆。细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达,并利用ＴＵＮＥＬ法观察细胞凋亡情况。结果：ＢＭＰ２基因成功导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞并得到表达。转染细胞的凋亡细胞阳性率与未转染细胞相比有显著性差异。结论：ＢＭＰ２能够诱导细胞凋亡,且这种作用与细胞所处的生长分化状态密切相关。