三裂叶豚草花粉新致敏蛋白组分超氧歧化酶克隆表达与致敏性

目的 克隆和表达三裂叶豚草花粉中的一种新致敏蛋白组分超氧歧化酶,探讨其在中国人群中的致敏特征。方法 通过对三裂叶豚草花粉转录组学研究,鉴定到一种潜在的超氧歧化酶基因序列,对基因进行克隆,通过表达和纯化获得蛋白,用clustalX2将已报道的超氧歧化酶与该基因进行多重序列比对,通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)研究三裂叶豚草花粉超氧歧化酶的致敏性。结果 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶序列编码区含465个碱基,编码154个氨基酸。多重序列比对发现三裂叶豚草花粉超氧歧化酶与橄榄花粉过敏原Ole e 5氨基酸序列存在一定的保守性,为53.9%。ELISA结果显示三裂叶豚草花粉超氧歧化酶的IgE结合率为12%(5/42),5份阳性血清在免疫印迹实验中均显示阳性结合带。结论 三裂叶豚草花粉超氧歧化酶是一种新的致敏蛋白组分,本研究对完善三裂叶豚草花粉过敏原组分信息具有重要意义,为三裂叶豚草花粉过敏疾病的组分解析诊断方法的建立奠定了基础。     

日本柳杉花粉变应原致敏蛋白组分

日本柳杉花粉变应原致敏蛋白组分目前已分离纯化并鉴定的有Cry j 1、Cry j 2、Cry j 3、CJP-6、CJP-4、CJP-8及CPA9等,其中某些致敏蛋白组分还具有多种异构体,因此日本柳杉花粉变应原的成分构成十分复杂。Cry j 1和Cry j 2是目前公认的日本柳杉花粉的主要致敏蛋白组分,二者均为糖蛋白,分子结构中均包含B细胞表位和T细胞表位,也与柏科其他植物花粉致敏蛋白组分具有很高的交叉反应性。其中Cry j 1具有果胶裂解酶活性,Cry j 2则有聚甲基半乳糖醛酸酶活性。后续发现的日本柳杉致敏蛋白组分Cry j 3、CJP-6、CJP-4、CJP-8及CPA9等也均有与花粉症患者血清IgE有较高的结合能力,这些蛋白质特点各异,但都具有与其他植物来源变应原的交叉反应性。     

柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1的分离纯化

目的 提取和分离纯化柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1.方法 使用40 mmol/L NH4 HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取,利用离子交换层析初步纯化其主要致敏蛋白Cup a 1,收集400 mmol/L NH4 HCO3组分的洗脱液,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对收...     

紫茎泽兰花粉变应原的蛋白组分

目的明确紫茎泽兰花粉变应原的蛋白组分,探索紫茎泽兰花粉是否为云南主要的春季致敏花粉之一。方法适时采集紫茎泽兰花粉制成变应原浸液,提取蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其蛋白组分大小并比较其与青蒿花粉蛋白组分的相似性。结果SDS-PAGE电泳检测发现,青蒿花粉有6条蛋白条带,相对分子质量分别为64000、34000、22000、17000、14000和7000;紫茎泽兰有4条蛋白条带,相对分子质量分别为22000、17000、14000和7000。青蒿和紫茎泽兰蛋白条带平均灰度值基本相同(P0.05)。结论紫茎泽兰和青蒿花粉有4条相对分子质量相近的蛋白条带,提示两种花粉可能有相似的变应原致敏成分,紫茎泽兰花粉可能是云南省主要的春季吸入性变应原之一。     

DNA聚合酶γ的提取、纯化和鉴定

目的:提取并纯化人宫颈癌细胞(HeLa)的线粒体DNA聚合酶γ(DNA polymeraseγ,Polγ),鉴定其纯度和活性.方法:运用离子交换层析等方法提取纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,并用Bradford法检测蛋白浓度.经SDS-PAGE检测蛋白纯度和相对分子量,Western blotting验证蛋白.用α-~(32)P- dTTP掺入法,液体闪烁计数器进行放射性测量以确定Polγ的活性.结果:成功提取并纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,经SDS-PAGE鉴定,有一个大约140 kDa的亚基单位,Western blotting证实为Polγ.对其进行150倍纯化,收得率为6%,酶的总活力为4.81 U,比活力为36.17 U/mg.结论:HeLa细胞的线粒体Polγ通过离子交换层析法提取和纯化后活性较高,可用于体外药物线粒体毒性的检测.     

人血清载脂蛋白AI的大量分离、纯化及鉴定

采用正常人血清为原料，利用硫酸右旋糖酐浓缩血清、密度梯度区带离、脱脂和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０柱层析技术，获得人血清载脂蛋白ＡＩ的纯品，经十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、分子量测定等证明，所提取的载脂蛋白ＡＩ为纯品，分子量为２８１８０。本方法的优点是，通过浓缩血清，减少了离心次数，缩短了制备时间，且分离效果好，为大量制备纯净的载脂蛋白ＡＩ提供了一种新的方法。     

大籽蒿花粉新致敏蛋白组分肌动蛋白(组装)抑制蛋白的鉴定、致敏性及表位

目的研究大籽蒿花粉新致敏蛋白组分肌动蛋白(组装)抑制蛋白(profilin)的基因信息、致敏情况、结构模型和B细胞表位。方法通过转录组测序分析鉴定到一个潜在的profilin基因序列;克隆其基因,表达和纯化得到其蛋白。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹实验研究其致敏性;并利用同源模拟,构建三维结构模型。结果 ELISA表明大籽蒿花粉profilin在蒿属花粉过敏患者血清中的IgE结合率为22%(11/50)。免疫印迹实验表明11份阳性血清中仅5份显示阳性条带。综合分析氨基酸序列和结构模型,获得5个线性B细胞表位和3个构象性B细胞表位。结论大籽蒿花粉profilin在蒿属过敏患者的致敏率为22%,构象性表位在profilin致敏中发挥作用。     

约氏疟原虫保护性抗原快速蛋白液相色谱法纯化及鉴定

目的：建立制备级纯化约氏疟原虫（Ｐ．ｙ．）保护性抗原的新方法。方法：应用快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ），将重度感染Ｐ．ｙ．的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠血液中提取的粗抗原，首先用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶色谱柱进行分离，收集活性组分，再用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱进一步纯化。结果：一次上样量约２００ｍｇ，可得到纯化抗原１４ｍｇ。经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）测定抗原纯度＞９０％，抗原分子量为５３ｋＤａ。结论：动物实验证明，该抗原具有很好的保护作用。该法操作比亲和色谱法简单，制备量大于亲和色谱法和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ），纯化效率和纯度与ＨＰＬＣ法相似，一次纯化周期仅需３ｈ，是Ｐ．ｙ．抗原纯化的高效方法。     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及鉴定

目的构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并进行纯化及鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE,Western blot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结果成功构建了Hsp16.3原核表达载体pET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白分子质量单位约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达,纯化Hsp16.3蛋白具有生物学活性,为Hsp16.3的进一步研究奠定了基础。     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的 为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白２（ＨＲＰ２）应用于疟疾诊断和疫苗研究,本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的ＨＲＰ２。方法 将ＨＲＰ２基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２;诱导ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２转化的ＢＬ２１菌,纯化表达产物并免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠;以免疫色谱法鉴定表达产物,以免疫小鼠血清对受染红细胞（ＩＲＢＣ）进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 成功构建了ｐＧＥ     

腐食酪螨过敏原的分析鉴定与纯化

目的 分析、鉴定与纯化腐食酪螨过敏原组分。 方法 以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定腐食酪螨蛋白质提取液中的蛋白质组分和过敏原组分，并通过阴离子交换层析和分子排阻色谱进一步纯化。 结果 腐食酪螨的蛋白质粗浸液电泳后可以辨认的蛋白质带共23条，相对分子质量（Mr）分别为177 000、118 000、107 000、70 000、67 000、60 000、52 000、45 000、41 000、40 000、38 000、37 000、35 000、27 000、23 000、22 000、18 000、17 000、16 000、15 000、14 000、13 000和12 000。Western blotting分析显示，腐食酪螨的5条致敏蛋白质带分别为Mr 128 000、67 000～70 000、36 000～37 000、18 000和16 000，其中前3条带特异性结合IgE阳性率均为100％，而Mr 18 000和Mr 16 000条带的阳性反应率分别为77.8%和44.44%。通过阴离子交换层析和分子排阻色谱从腐食酪螨粗浸液中分离到Mr 18 000的过敏原组分。 结论 腐食酪螨有4种主要过敏原及1种次要过敏原。     

胰腺癌内皮细胞的分离纯化和鉴定

背景：以正常血管内皮细胞替代肿瘤内皮细胞进行抗肿瘤血管生成研究是一种间接、模拟的研究方式。其局限性显而易见,而以肿瘤内皮细胞为研究对象可提供更为直接、有效、真实的证据。目的：建立胰腺癌内皮细胞的分离纯化、鉴定方法。方法：构建胰腺癌原位荷瘤裸鼠模型,应用免疫磁珠技术,以结合有CD31单克隆抗体的磁珠从胰腺原位移植瘤中分离纯化胰腺癌内皮细胞,通过光学显微镜观察、免疫荧光染色和乙酰化低密度脂蛋白（Ac—LDL）摄取实验从细胞形态、表面标记物和功能三个层面对所获细胞进行鉴定。结果：从裸鼠胰腺原位移植瘤中分离纯化得到的CD31阳性细胞在光学显微镜下呈典型“铺路石样”改变,CD34／VE．cadherin、CD31／VEGFR．2免疫荧光双染色均为阳性,95％以上的细胞DiI标记的Ac．LDL摄取实验结果呈阳性。结论：本研究成功建立了胰腺癌内皮细胞的分离纯化、鉴定方法,可用于胰腺癌肿瘤血管发生机制和抗肿瘤血管生成新药的研究。     

细粒棘球蚴重组抗原 B的制备、纯化及鉴定

目的 制备细粒棘球蚴人工重组抗原B。 方法 构建pMalc2x-AgB质粒，在原核系统大肠埃希菌 JM109中诱导表达，将所得融合蛋白rAgB-MBP用蛋白水解酶Xa（Factor Xa Protease）进行消化，酶切产物用两步亲和层析进行分离纯化。经过直链淀粉树脂柱、羟基磷灰石柱，获得了纯化的细粒棘球蚴人工重组抗原B，并用Western blotting对抗原B的特异性进行了鉴定。 结果 制备的抗原B（rAgB）相对分子量（Mr）为12 000，rAgB经过原核表达、酶切、层析柱分离后依然保持抗原活性。 结论 用分子生物学手段制备并纯化了人工重组抗原B，为批量生产诊断抗原、制备单克隆抗体及筛选噬菌体抗体库奠定了基础。     

豚草在中国的蔓延及治理措施

豚草是一种外来入侵的有害植物,自20世纪30年代传入中国,根据气传花粉调查、野外考察资料发现,豚草已蔓延到我国12个省的30多个城市。豚草花粉已成为我国过敏性鼻炎和支气管哮喘的重要病因之一。此外,豚草破坏生态环境,对农牧业造成严重危害并带来巨大的经济损失。因此,必须采取有效的防除措施。进入21世纪后,豚草在中国的蔓延及治理措施如何,本文对此进行综述。     

丽江市大气花粉分布及其与变态反应性疾病的关系

目的为探明丽江市空气中花粉飘散特点,为当地变态反应性疾病患者提供特异性诊断、治疗和预防的依据。方法采用重力沉淀法,于2007年11月1日至2009年10月31日对丽江市进行连续2年的大气花粉曝片调查,同时对470例变态反应性疾病患者进行花粉变应原皮试,并询问发病季节。结果丽江市空气中常年有花粉飘散,两年共收到孢粉63027粒,已鉴定79个科属种;每年出现两次高峰,即3-5月和9-10月。花粉变应原皮试阳性率77.87%,春季主要致敏花粉为黎、油菜、松、柏,秋季主要致敏花粉为蒿、旱冬瓜,蒿属花粉为丽江市致敏性最强的花粉。变态反应性疾病的发生与花粉的数量和种类相关,发病季节与花粉飘散特点相吻合。结论花粉是丽江市变态反应性疾病的主要致敏原之一。     

云南省曲靖市区气传花粉调查

目的为探明曲靖市区气传花粉飘散的种类、数量及季节分布特点,以指导本地区对花粉症的预防和脱敏治疗。方法采用全国统一的重力沉淀法,于2006年7月至2007年7月对曲靖市区进行一年曝片调查,对全年收集到的365张曝片进行显微鉴定和统计处理。结果全年共收到花粉56356粒,其中裸子植物33066粒,占58.7%。被子植物22552粒,占40%。蕨类植物738粒,占1.3%。裸子植物有9个科、属、种,被子植物有49个科、属、种,蕨类植物主要有三缝花和单缝花两个类型。全年有两个花粉高峰,分别为2-4月以松、柏、蔷薇、桑科为主的春季花粉高峰和9-11月以旱冬瓜、蒿属为主的秋季高峰,其他月份花粉数量相差不大。蕨类植物花粉数量不多,但常年均有飘散。结论与全国及云南其他各地比较,曲靖市空气中花粉飘散的数量最多、种类也多,且常年均有飘散,尤其是桑科、豆科、蒿属、柳属、杨属、旱冬瓜、油菜花粉的数量较其他地区更为突出。     

葎草花粉变应原免疫治疗疗效和安全性评估

目的回顾性评价单一葎草花粉变应原制剂治疗葎草花粉过敏性鼻炎伴发或不伴发过敏性哮喘的疗效和安全性。方法回顾近13年接受单一葎草花粉变应原免疫治疗(SIT)的葎草花粉过敏性鼻炎患者,比较SIT治疗前后过敏性鼻炎临床症状的严重程度,症状持续时间,治疗药物,总体自评和不良反应;对伴发过敏性哮喘患者比较SIT治疗前后发病季节哮喘控制测试(ACT)评分,治疗药物和总体自评。结果 40例葎草花粉过敏性鼻炎患者中7例(17.5%)伴发过敏性哮喘。过敏性哮喘患者的哮喘症状晚于鼻炎症状4(3,6)年出现,7例过敏性鼻炎伴过敏性哮喘患者中5例(71.4%)在鼻炎发病5年内发展伴发过敏性哮喘。SIT治疗前后,过敏性鼻炎症状总评分[10(9,11)vs.5(4,6)]、症状年累计时间[8(8,12)周vs.4(4,7)周]、药物积分[385(320,465)vs.125(69,200)]差异均有统计学意义(均P<0.001),85%总体自评为病情改善。2例患者发生全身不良反应,其中Ⅱ类和Ⅲ类各1例次。伴发过敏性哮喘的7例患者经SIT治疗,6例发病季节ACT评分由未控制改善为完全或良好控制,治疗前后哮喘药物积分[240(110,250)vs.25(0,70)]差异有统计学意义(P<0.05),所有患者总体自评均为明显改善。结论使用葎草花粉变应原单一制剂可有效、安全地治疗葎草花粉过敏性鼻炎伴发或不伴发过敏性哮喘。     

大籽蒿花粉变应原皮试液诊断大籽蒿花粉过敏的临床评价

目的评价应用蒿属花粉变应原注射液原液1：1000稀释液进行皮内试验诊断蒿属花粉过敏的有效性和安全性。方法回顾性分析2009年2月至7月于北京协和医院变态反应科就诊的1043例患者皮内试验结果,将蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液皮内试验结果分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断及血清特异性IgE（specificIgE,sIgE）诊断结果进行对比,评价皮内试验诊断蒿属花粉过敏的特异度和敏感度及与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清sIgE诊断结果的一致性。同时评价蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液用于皮内试验的安全性。结果以变态反应专科医生临床综合特异性诊断结果作为金标准,将蒿属花粉皮内试验结果≥“＋”作为诊断界值,蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液皮内试验灵敏度为95．99％,特异度为84．36％,阳性预测值为85．01％,阴性预测值为95．79％,准确度为89．95％,ROC曲线下面积为0．956,95％的可信区间为（0．943—0．970）。当以蒿属花粉皮内试验结果≥“＋＋”为诊断界值时,蒿属花粉皮内试验灵敏度为79．29％,特异度为97．33％,阳性预测值为96．48％,阴性预测值为83．57％,准确度为88．66％。次要评价指标以PhadiaUni-CAP系统血清蒿属花粉变应原sIgE诊断结果作为标准,将蒿属花粉皮内试验结果≥“＋”作为诊断界值时,蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液皮内试验的灵敏度为95．23％,特异度为45．98％,阳性预测值为88．97％,阴性预测值为67．80％,准确度为86．39％。如以蒿属花粉皮内试验结果≥“＋＋”为诊断界值时,则皮内试验灵敏度78．89％,特异度为96．55％,阳性预测值为99．05％,阴性预测值为50．00％,准确度为82．06％。蒿属花粉血清sIgE阳性组中,血清sIgE水平与蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液的阳性反应程度的等级相关系数为0．68728。1043例受试者中,与蒿属花粉变应原有关的局部不良反应为7．01％（73／1043）;仅有1例患者出现全身不良反应,该患者同时合并律草花粉、圆柏花粉过敏。结论使用蒿属花粉变应原注射原液1：1000稀释液进行皮内试验,可以有效、安全地诊断蒿属花粉引起的过敏性疾病。     

蒿属、葎草花粉空气浓度与夏秋季花粉症患者哮喘症状严重程度的相关性

目的评价空气中蒿属花粉、葎草花粉浓度与夏秋季花粉症患者哮喘症状严重程度及肺通气功能的相关性。方法通过典型病史和体征、过敏原皮肤试验、血清特异性IgE检测、肺通气功能试验筛选出106例夏秋季花粉症患者,男性49例、女性57例,年龄10～73岁;从2006年7月1日～2008年10月31日,连续记录患者每日呼气峰值流速(PEF)及哮喘症状积分,并与同期空气中花粉浓度进行比较。结果蒿属花粉过敏性哮喘患者的日哮喘症状积分、夜哮喘症状积分、日PEF%、夜PEF%、PEF日内变异率与空气中蒿属花粉浓度显著相关(rs=0.762、rs=0.682、rs=-0.649、rs=-0.596、rs=0.549,P<0.001);葎草花粉过敏性哮喘患者的日哮喘症状积分、夜哮喘症状积分、日PEF%、夜PEF%、PEF日内变异率与空气中葎草花粉浓度显著相关(rs=0.817、rs=0.783、rs=-0.833、rs=-0.785、rs=0.454,P<0.001);花粉浓度增高时患者PEF监测值明显降低,而哮喘症状积分、PEF日内变异率则明显增高。结论蒿属花粉、葎草花粉可以引起中国北方地区夏秋季过敏性哮喘。