结缔组织生长因子和金属蛋白酶组织抑制因子-1 RNA干扰靶位的筛选

目的筛选能有效抑制肝纤维化形成的结缔组织生长因子（CTGF）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的RNA干扰靶位。方法根据大鼠CTGF和TIMP-1基因序列,分别设计3个RNA干扰候选靶位,化学合成双链RNA（dsRNA）,各自转染或不同组合后转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞（HSC）,48h后抽提RNA并逆转录成cDNA,采用荧光定量PCR法测定并计算CTGF和TIMP-1、Ⅰ型前胶原（procol-α1）mRNA的相对表达量与抑制率,采用RIA法检测HSC培养上清液肝纤维化指标。结果在进行单独针对CTGF基因干扰时,CTGF-3组对CTGF mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.09%与65.03%）,在单独针对TIMP-1基因干扰时,TIMP-1-3组对TIMP-1 mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.55%与62.84%）;在联合干扰时,CTGF-3/TIMP-1-3组联合对CTGF mRNA和TIMP-1 mRNA的抑制最强（抑制率分别达76.60%与79.03%）,而以CTGF-2/TIMP-1-3组联合对Procol-α1 mRNA的抑制作用最强（抑制率达85.79%）。结论成功筛选出针对CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位,联合干扰较单独干扰效果更强。     

TIMP-1特异性小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞效率的检测

目的 提高TIMP-1小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA在大鼠肝星状细胞HSC-T6中的转染效率.方法 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA,采用阳离子脂质体介导法将pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA质粒转染入HSC-T6细胞,实验根据质粒DNA和阳离子脂质体LipofectamineTM 2000的不同比例分为5组:2 μg/0μL、2 μg/4 μL、2 μg/6 μL、2 μg/8 μL、2 μg/10 μL,同时设空白对照组.转染48 h后,应用激光共聚焦显微镜观察各组转染情况,同时用流式细胞仪计算转染效率.结果 激光共聚焦显微镜观察和流式细胞仪检测均说明质粒与脂质体比例为2 μg/8 μL组转染效率显著高于其余各比例组,差异具有统计学意义.转染效率与脂质体和质粒的比例有关.结论 按照合适的质粒和脂质体比例,质粒pGCsi-U6/TIMP-1 shRNA转染HSC-T6可达较高转染效率,是转染HSC-T6较为理想的瞬时表达载体.     

重组结缔组织生长因子shRNA质粒的构建及其对肝星状细胞基因表达的影响

[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shRNA质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响。[方法]针对大鼠CTGF mRNA靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shRNA分别链接到质粒pGenesil1.2载体的U6启动子和H1启动子。将构建的干扰质粒以阳离子脂质体法转染HSC-T6细胞,应用RT-PCR及Western Blot检测CTGF的表达。[结果]成功构建CTGF shRNA重组质粒;通过RT-PCR和Western Blot分析发现干扰质粒组的CTGF mRNA与蛋白表达水平明显下降(P0.05)。[结论]重组CTGF shRNA能有效抑制HSC中CTGF的表达。     

结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1shRNA表达质粒对肝星状细胞细胞因子表达及细胞外基质分泌的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒分别及共转染肝星状细胞(HSC)对CTGF、TIMP-1、I型前胶原(PCI)mRNA表达及细胞外基质(ECM)分泌的影响. 方法 筛选并成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1有效RNA干扰靶位的shRNA表达质粒,分别及共转染转化生长因子β1刺激活化的大鼠HSC-T6细胞,荧光定量PCR检测各组细胞中CTGF、TIMP-1、PCI mRNA的表达;放射免疫法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LN)的含量.组间比较采取方差分析;多组间两两比较采用SNK-q检验. 结果 CTGFshRNA转染和双质粒共转染HSC-T6的CTGFmRNA相对表达量分别为0.59±0.03、0.62±0.01,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.00±0.07比较,CTGF mRNA表达量均明显下降,F=66.515,P值均＜0.05,差异有统计学意义;而TIMP-1 shRNA组和双质粒共转染组的TIMP-1 mRNA相对表达量分别为0.66±0.04、0.68±0.03,与空白对照组、CTGFshRNA转染组的1和1.05±0.03比较,TIMP-1 mRNA表达量均明显下降,F=83.835,P值均＜0.05,差异有统计学意义;CTGFshRNA转染、TIMP-1shRNA转染和共转染组的PCI rnRNA相对表达量分别为0.55±0.02、0.57±0.02和0.41±0.01与空白对照组的1比较,PC I mRNA表达量均明显下降,F=709.905,P值均＜0.05,差异有统计学意义;双质粒联合转染对CTGF、TIMP-1、PC I的mRNA表达量抑制作用优于单质粒转染.CTGF shRNA转染、CIGF shRNA转染和双质粒共转染组的PCⅢ含量分别为(78.02±6.50) ng/ml、(79.03±5.47) ng/ml、(53.91±4.01)ng/ml,与空白对照组的(113.79±15.88)比较,PCⅢ含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义; CTGF shRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的HA含量分别为(127.36±8.33)ng/ml、(116.55±3.37) ng/ml、(82.84±9.03) ng/ml,与空白对照组的(163.10±7.01)ng/ml比较,HA含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义CTGFshRNA转染、CTGF shRNA转染和双质粒共转染组的LN含量分别为(55.41±9.37)ng/ml、(49.77±6.70) ng/ml、(30.72±1.22) ng/ml,与空白对照组的(83.99±4.67) ng/ml比较,LN含量均明显下降,P值均＜0.05,差异有统计学意义.CTGF shRNA与TIMP-1 shRNA双质粒联合转染对PCⅢ、HA、HA分泌的抑制作用优于单质粒转染.结论 CTGF shRNA.TIMP-1 shRNA可明显抑制HSC的CTGF、TIMP-1、PCI基因表达及ECM的分泌,且shRNA联合干扰效果更显著,有望成为抗肝纤维化基因治疗的有效方法.     

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞MMP-1和TIMP-1表达的作用研究

目的 构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因（NOV）的小干扰RNA（siRNA）的重组质粒，研究NOV对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达的影响。方法 以NOV为目的基因，以质粒psiRNA-hH1 neo为载体，构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA（psiRNA1、2、3）和阴性对照重组质粒pconsiRNA。限制性酶切和测序鉴定构建成功后，脂质体介导重组质粒转染HSC，依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组，并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组。半定量RT-PCR检测HSC的NOV、MMP-1、TIMP-1 mRNA表达情况，MTT法检测细胞增殖。结果限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOV siRNA表达质粒；与阴性对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV的mRNA表达水平下降（P〈0．05），MMP-1mRNA表达水平下降不明显（P〉0．05），而TIMP-1 mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。与空白对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC增殖活性显著降低（P〈0．05）。psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV、MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达及HSC增殖活性均无明显下降（P均〉0．05）。结论NOV可促进HSC增殖及表达TIMP-1增加，而对MMP-1表达影响不大，提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点。     

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞生物学行为的影响

目的:构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因(NOV)的小干扰RNA(siRNA)的重组质粒,研究NOV对大鼠肝星状细胞(HSC)活化、增殖、凋亡、分泌细胞外基质(ECM)的影响方法:以NOV为目的基因,以质粒psiRNA- hHlneo为载体,构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA (psiRNA1,2,3)和阴性对照重组质粒pconsiRNA.限制性酶切和测序鉴定构建成功后,脂质体介导重组质粒转染HSC,依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组,并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组.半定量RT-PCR检测HSC的NOV、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达情况,Western blot检测α-SMA蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOVsiRNA表达质粒:与阴性对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV、α-SMA的mRNA表达水平下降(73.0% vs 23.2%,51.4% vs 15.1%,均P<0.05),Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显下降(59.8% vs 17.0%,37.1% vs 6.6%,P<0.05),α-SMA蛋白表达水平下降.与空白对照组相比,转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内HSC增殖活性显著降低(24 h:0.172±0.005 vs 0.318±0.018.P<0.05:48 h:0.296±0.004 vs 0.472±0.029,P<0.05:72 h:0.432±0.024 vs 0.672±0.050,P<0.05).psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV mRNA、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达及HSC增殖活性均无明显下降(均P>0.05).结论:NOV可促进HSC增殖、活化及分泌细胞外基质,提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点.     

转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 用RNA干扰技术,分别以转化生长因子(TGF)β 1、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法 设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的 基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%(F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01),TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%(F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01).结论 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的 基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

Abstract：

Objective To construct the siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGF β1,TIMP-1 and TIMP-2 and to investigate the inhibitory efficiency of target genes expression on rat hepatic stellate cell in vitro. Methods The siRNA cDNA sequences ofTGF β 1, TIMP-1 and TIMP-2 were designed,synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1 respectively to generate eukaryotic expression plasmids.The plasmids were transfected into HSC T6 cells in vitro and the inhibitory efficiency of target genes expression was observed with real-time PCR and Western blot. Results The eukaryotic expression vectors were constructed successfully. The expressions of TGF β1 mRNA, TIMP-1 mRNA and TIMP-2mRNA in siRNAtransfected groups were decreased by 63.4% ± 8.0%, 64.5% ± 9.0% and 55.0% ± 17.0% respectively and the expressions of TGF β1 protein, TIMP-1 protein and TIMP-2 protein were decreased by 57.8% ± 3.0%,55.1% ± 5.0%, 49.3% ± 1.0% respectively as compared to the control groups. Conclusions The siRNA eukaryotic expression vectors constructed targeting on TGF β1, TIMP-1 and TIMP-2 could reduce the expressions of target genes and they might be able to used for the exploration of new anti-fibrosis drugs genetically.     

抑制结缔组织生长因子表达对肝星状细胞增殖和活化的影响

目的观察抑制结缔组织生长因子（CTGF）表达对肝星状细胞系HSC-T6细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法构建含有靶向CGTF小干扰RNA的重组慢病毒载体并感染HSC-T6细胞,应用MTT法检测细胞增殖情况;应用PI染色和流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果抑制CTGF基因表达可抑制HSC-T6细胞增殖,同时显著增加HSC-T6细胞凋亡,凋亡细胞的百分比为17.58±5.81%,明显高于空白对照组（5.12±1.21%）和阴性对照组（1.37±0.31%）;抑制CTGF基因表达可显著升高S期细胞百分比（53.24±4.47%）,空白对照组和阴性对照组分别为44.80±4.701%和42.10±1.40%,而处于G2~M期细胞百分比（0.04±0.07%）则较空白对照组（9.03±0.45%）和阴性对照组（12.19±5.62%）显著降低,但抑制CTGF对G0~G1期细胞百分比无影响。结论抑制CTGF可促进HSC-T6细胞凋亡,抑制其活化和增殖。抑制CTGF基因表达有可能作为抗肝纤维化的新靶点。     

靶向CTGF锤头核酶对TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Ⅰ型胶原的作用

目的:探讨靶向结缔组织生长因子(CTGF)的锤头核酶抑制TGF-β1作用下人肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)合成及其细胞周期进程的作用.方法:构建含有人CTGF锤头核酶cDNA序列的重组质粒pTriCTGF-Rz.将空质粒pTriEx2和重组质粒pTriCTGF-Rz分别转染人肝星状细胞系(LX-2)细胞.细胞分为4组:pTriEx2转染组,pTriEx2转染加TGF-β1组,pTriCTGF-R2转染加TGF-β1组和pTriCTGF-Rz转染组.采用半定量RT-PCR测定LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录水平,采用ELISA和流式细胞仪分别用于LX-2细胞Col Ⅰ分泌功能和LX-2细胞周期进程的检测.结果:TGF-β1可明显提高LX-2细胞CTGFmRNA和Col Ⅰ mRNA的转录水平及分泌Col Ⅰ蛋白功能(t=11.14,14.36,7.17,均P＜0.01);pTriCTGF-Rz转染LX-2细胞既能降低基础CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA水平及Col Ⅰ蛋白水平(t=2.86,3.06,2.97,均P＜0.05),又能部分拮抗TGF-β1诱导LX-2细胞CTGF mRNA和Col Ⅰ mRNA转录和Col Ⅰ蛋白分泌的增加(t=2.99,3.09,3.02,均P＜0.05).TGF-β1对LX-2细胞周期进程无影响.结论:CTGF是TGF-β1作用下人肝星状细胞合成Col Ⅰ的下游介导者,TGF-β1对HSC周期进程无影响,靶向CTGF有可能成为肝纤维化基因治疗的新靶点.     

靶向胰腺癌PANC-1细胞整合素连接激酶基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的:构建整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组质粒并检测其对胰腺癌PANC-1细胞ILK基因表达的干扰效率,为进一步研究胰腺癌中ILK基因功能奠定实验基础和理论依据.方法:设计并构建3条含有针对ILK基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列的重组质粒并进行DNA测序.通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转入人胰腺癌细胞株Panc-1细胞中,G418压力筛选至得到稳定转染细胞克隆,利用Real-Time PCR和Western blot检测ILK基因的表达抑制情况.筛选出干扰效率最高的重组质粒.结果:经DNA测序证实胰腺癌PANC-1细胞ILK基因的R NA干扰重组质粒构建成功;重组质粒稳定转染Panc-1细胞后(各组转染效率均>90%),各实验组ILK基因表达均被有效地抑制,其中重组质粒-2的干扰效率最高,其mRNA及ILK表达显著下调,其抑制率分别为93.01%和65.69%;ILK mRNA表达较阴性对照组、空质粒组表达量显著下降(0.090±0.009vs 1.147±0.110,1.005±0.121,P<0.01).结论:成功构建ILK基因RNA干扰重组质粒,重组质粒能有效抑制胰腺癌Panc-1细胞ILK基因表达.为进一步研究ILK在胰腺癌中的基因功能奠定基础.     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

体外RNA干扰下调黏着斑激酶表达对HSC-T6细胞黏附与迁移的影响

目的 探讨特异性阻断黏着斑激酶(FAK)表达对纤维连接蛋白刺激的肝星状细胞(HSC-T6)黏附与迁移的影响.方法 构建靶向FAK的RNA干扰重组体,在阳离子聚合物介导下转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,筛选出可高效抑制FAK表达的重组质粒;荧光实时定量PCR和Western blot检测FAK基因敲除效果;甲苯胺蓝染色法检测细胞黏附,划痕修复实验和改良的Boyden双腔系统检测细胞迁移.多组间均数差异性比较采用单因素方差分析.结果 成功构建并筛选出可高效抑制FAK的质粒表达载体.质粒转染后,FAK mRNA和蛋白表达分别下降了76.82%和72.53%,同时,p-FAK(Tyr397)蛋白表达下降了62.71% FAK表达下调可明显抑制HSC-T6细胞黏附,抑制率约58.69%;FAK基因沉默可显著抑制纤维连接蛋白诱导的HSC迁移,使细胞迁移距离降低了58.27%,跨膜迁移细胞数减少了83.70%. 结论 RNA干扰技术可选择性下调HSC中FAK的表达,并可显著抑制HSC-T6的黏附和迁移.     

MMP-1过表达抑制人肝星状细胞I型胶原表达

目的观察人肝星状细胞（LX-2）过表达基质金属蛋白酶-1（MMP-1）后,肝纤维化相关指标的变化。方法构建含MMP-1全长编码基因的表达质粒,并转染人肝星状细胞,荧光定量PCR与Western blot法分别检测MMP-1、I型胶原（collagenI）、TIMP-1基因与蛋白水平的表达。结果成功构建含MMP-1全长编码基因的表达质粒dl6-95-MMP-1;dl6-95-MMP-1转染LX-2细胞7d后,荧光定量PCR结果显示,MMP-1基因转录水平显著增加,而CollagenI、TIMP-1在基因转录水平无明显改变;Western blot结果显示转染7d后,MMP-1蛋白表达明显增加,CollagenI蛋白表达明显下降,而TIMP-1蛋白表达无明显变化。结论人肝星状细胞高表达MMP-1后显著抑制CollagenI蛋白的表达,其机制主要通过发挥其酶活性降解collagenI蛋白,而不影响collagenI基因水平的表达,同时也不影响TIMP-1在基因以及蛋白水平的表达。     

黏着斑激酶相关非激酶对CFSC细胞基质金属蛋白酶-2及其抑制因子mRNA表达的影响

目的 探讨黏着斑激酶相关非激酶(FRNK)对纤维连接蛋白刺激的肝星状细胞CFSC胶原代谢的影响及其分子机制. 方法用体外细胞培养技术,脂质体介导法进行FRNK质粒瞬时转染;采用Western blot方法测定FRNK蛋白表达,鉴定转染效果;用3H-Pro掺入技术测定CFSCI型胶原的合成;用RT-PCR方法测定FRNK转染前后基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其抑制因子(TIMP-2)基因在CFSC中表达的变化情况. 结果 FRNK质粒成功转染CFSC,Ⅰ型胶原合成下降;MMP-2基因表达上升,TIMP-2基因表达下降,MMP 2/TIMP-2比值明显上升.结论 外源性FRNK在CFSC内大量表达后,CFSC胶原表达减少;FRNK可能通过调节MMP-2/TIMP-2比值来促进CFSC的胶原降解.     

RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

目的观察RNA干扰（RNAi）对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白（Paxillin）表达的沉默作用。方法构建针对Paxillin基因序列的短发卡RNA（shRNA）表达载体,并转染至结肠癌HCT-8细胞,72 h后分别用实时定量PCR和Western blot法测定转染细胞中Paxillin mRNA及蛋白。结果根据针对Paxillin基因设计了小干扰RNA（siRNA）序列,构建了shRNA表达载体,并成功转染至HCT-8细胞。以空白对照组作均一化,转染Paxillin-shRNA_1、Paxillin-shRNA_2、Paxillin-shRNA_3、Paxillin-shRNA_NC的细胞及空白对照组细胞Paxillin mRNA相对表达量分别为0.66±0.28、0.31±0.11、1.00±0.22、1.05±0.32、1.00±0.29,Paxillin蛋白相对表达量分别为0.62±0.11、0.39±0.13、0.74±0.21、0.94±0.09、1.00±0.16。结论 RNAi可沉默结肠癌HCT-8细胞Paxillin的表达。     

RNA干扰沉默HIF-1α基因对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响

目的 观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α （HIF-1α）基因对人舌癌细胞Tca8113侵袭和迁移的影响.方法 将3个shRNA序列质粒导入pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA质粒表达载体,并将重组质粒经脂质体介导转染人舌癌细胞Tca8113（siHIF-1α组）,转染阴性对照质粒的细胞作为空载组.半定量RT-PCR及Western blot法检测HIF-1α的mRNA及蛋白,细胞侵袭实验和划痕实验检测Tca8113的侵袭和迁移能力,同时采用Western blot法检测其上皮-间质转化（EMT）相关标志蛋白和黏着斑激酶（FAK）、磷酸化FAK（P-FAK）.结果 测序证实成功构建了HIF-1α shRNA重组质粒（分别为sh1、sh2、sh3）,将sh3,转染Tca8113后进行低氧培养,HIF-1α基因表达显著被抑制.与空载组相比,转染sh3的siHIF-1α组穿透Matrigel胶的细胞数明显减少,且迁移能力也显著下降,两组相比,P均＜0.05.与对照组（未转染质粒的Tca8113）相比,siHIF-1α组EMT相关标志蛋白和p-FAK蛋白表达下降,两组相比,P均＜0.05.结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因能有效抑制舌癌细胞的侵袭和迁移,在一定程度上可以逆转舌癌细胞的恶性表型.