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目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础. 相似文献
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乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(Pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-PreS1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白3(PSITP3),已在GenBank中注册,注册号:AY446274。PSITP3基因的编码序列全长为1173个核苷酸(nt),编码产物由390个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。 相似文献
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目的 应用微矩阵(microauray)技术,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因,阐明授性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定,构建真核表达载体PcDNA3.1(-)-NS5A。以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCVKDA反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苔酸序列分析证实正确无误。以PcDMA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总MA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP13,在GenBank中登录,登录号为D21262。Ns5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt),编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用。微短阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术。应用这些技术,发现了HCVKDA反式激活作用的新的靶基因,将为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究 总被引:2,自引:1,他引:2
目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因,研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术,以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册,注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt),编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆,为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究 总被引:5,自引:1,他引:5
目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定,构建真核表达载体PcDNA3.1(-)-NS3。以pcDNA3.1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3.1(-)-NS3,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因,命名为NS3TP6,新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt),编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因,并成功克隆其中的NS3TP6,为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究 总被引:3,自引:1,他引:3
目的:对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究。方法:依据我室构建的HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列,对其氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究。结果:NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt),编码产物为204氨基酸残基(aa)。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因。结论:发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路。 相似文献
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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus.HCV)NS3/4A丝氨酸蛋白酶和NSSB RNA依赖的RNA聚合酶是病毒蛋白前体加工成熟和复制过程中十分重要的两个酶,是抗HCV治疗的理想靶点.近年来,关于HCV NS3/4A蛋白酶和NSSBRNA聚合酶抑制剂的研究是抗HCV研究最为活跃的方向,本文综述了他们在临床试验中的最新研究进展. 相似文献
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目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究 总被引:4,自引:3,他引:4
目的 为了探索丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用基因芯片技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系H叩G2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV—H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTN-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A。以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5AWll,新基因的编码基因序列全长为1257个核苷酸(nt),编码产物由418个氨基酸残基(aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。基因芯片技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向。 相似文献
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究 总被引:7,自引:0,他引:7
目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其基因利用多聚酶链反应技术(PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现,为阐明HCVV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向。 相似文献
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目的:对新基因NS5ATP2(615)转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能.方法:应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析我们研究组通过抑制消减杂交(SSH)技术筛选得到的新基因NS5ATP2(615)的全长编码序列,构建NS5ATP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615).应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP2(615)和pcDNA3.1(-)空载体分别转染的HepG2细胞的mRNA的差异性表达进行检测.结果:确定基因NS5ATP2(615)由615nt组成,编码204aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,NS5ATP2(615)表达质粒转染的细胞有40条差异表达基因,其中18条基因表达增强,22条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、肿瘤的发生密切相关.结论:基因表达谱芯片技术对于初步探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明NS5ATP2(615)生物学功能及HCV NS5A的致病机制提供了理论依据. 相似文献
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目的 丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用抑制性消减杂交(SSH)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCV NSSA表达质粒peDNA3.1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA,多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,测序证实,命名为NSSATP8在GenBank中注册,注册号为.AF529369.NSSATP8基因的编码序列全长为1449(nt),编码产物由483个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV NS5A反式激活新型靶基因NSSATP8筛选与克隆,进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。 相似文献