抗肿瘤和乙肝双交IL18—HBV S基因疫苗的构建

目的：探讨IL－18及乙肝病毒S基因（HBVS）的联合功效。方法：从胎肝组织中抽提总RNA，RT－PCR扩增IL－18cDNA基因。从载体pcDNA3．0／S中限制性酶切获取HBV S基因，然后，将其与IL－18cDNA一半亚克隆到真核表达质粒pIRES-EGFP中。结果：构建了具有抗肿瘤及乙肝双重功效的IL－18－HBV S乙肝基因疫苗。结论：含有IL－18基因的HBV基因疫苗的构建为基因疫苗的功能和应用研究提供了基础。     

抗肿瘤和乙肝双效IL18-HBV S基因疫苗的构建

[目的]探讨IL-18及乙肝病毒s基因(HBV s)的联合功效。[方法]从胎肝组织中抽提总RNA，RT-PCR扩增IL-18cDNA基因。从载体pcDNA3.0/S中限制性酶切获取HBV S基因，然后，将其与IL—18 cDNA一并亚克隆到真核表达质粒pIRES—EGFP中。[结果]构建了具有抗肿瘤及乙肝双重功效的IL18-HBV S乙肝基因疫苗。[结论]含有IL-18基因的HBv基因疫苗的构建为基因疫苗的功能和应用研究提供了基础。     

RNA干扰诱导DNA修复基因hMGMT表达沉寂的研究

背景与目的：构建能特异诱导人DNA修复基因hMGMT表达沉寂的RNA干扰载体。材料与方法：通过两步法聚合酶链反应（Polymerasing chain reaction,PCR）扩增hMGMT特异RNA干扰表达盒,连入质粒载体构建RNA干扰质粒pU6-MGMTi,与pGEFP-C1共转染人支气管上皮16HBE（Human bronchial epithelial）细胞,G418筛选后,采用RT-PCR和Westem Blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达抑制情况。结果：成功构建hMGMT特异RNA干扰质粒pU6-MGMTi,转染16HBE细胞的mRNA和蛋白表达受到显著的抑制。结论：应用RNA干扰表达盒以及共转染技术,构建MGMT基因表达沉寂的细胞株,为进一步阐明MGMT基因的功能创造条件。     

精子携带的乙肝病毒基因在金黄地鼠胚胎中的复制与表达

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。本研究旨在探索乙肝病毒(HepatitisBvirus,HBV)通过精子垂直传播的可能性。方法:将金黄地鼠精子与pBR322-HBVDNA重组质粒进行共培养后,与金黄地鼠正常卵母细胞受精,取2-细胞胚分别制片和提取RNA,用荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)、RT-PCR和免疫荧光检测技术研究精子携带的HBV基因在胚胎细胞中的复制与表达。结果:①FISH:用全长HBVDNA探针与128个2-细胞胚进行FISH,其中3个胚胎FISH结果阳性,每个胚胎的2个间期核上均有HBVDNA杂交信号;②RT-PCR:在检测样本中可见特异的HBxDNA阳性条带,阴性对照1(模板为灭菌水)和阴性对照2(未加反转录酶)均为阴性;③免疫荧光检测:2-细胞胚经血清封闭后,分成两组。一组作检测样本,另一组用PBS代替一抗(小鼠抗人HBsAg)作为阴性对照,检测样本中可见阳性免疫荧光信号,阴性对照未见信号。结论:以精子为载体,携带到卵内的HBV基因能够在胚胎细胞中复制和表达,提示HBV能够通过男性生殖细胞由父亲垂直传递给子代。     

GM-SCF与LMP2A融合基因GC2A重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因与EB病毒基因LMP2A融合基因GC2A的重组腺病毒表达载体。方法:将构建的融合基因GC2A定向亚克隆至质粒pAdTrack-CMV上,经酶切及电泳检测后,PmeL酶切pAdTrack-CMV-GC2A,与质粒pAdEasy-1一起电转化E.coli.BJ5183,筛选重组菌,经PacⅠ酶切鉴定后用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组腺病毒vAd-GC2A,采用pAdTrack-CMV-GC2A中报告基因GFP的表达,观测其表达情况。结果:采用内切酶Bg1Ⅱ和EcoRⅤ对质粒pAdTrack-CMV-GC2A进行双酶切分析,电泳后可观察到约1 961和9 200bp的片段。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切后观察到约33kb的DNA片段和4.5kb的DNA片段,说明pAdTrack-CMV-GC2A和pAdEasy-1的重组发生在ori和右臂区,pAd-GC2A经PacⅠ酶切线性化后,磷酸钙法转染293细胞,56h后在荧光倒置显微镜下可看到有绿色荧光出现,说明已转染成功,并能在293细胞中表达。结论:融合基因GC2A正确插入,真核表达载体vAd-GC2A成功构建,在293细胞中包装获得重组腺病毒。     

cyclin G2表达载体的构建及其对人胃癌细胞生长的作用

目的:构建包含人cyclinG2基因的真核表达载体,并探讨其对人胃癌细胞体外生长的作用。方法:从POE4细胞总RNA反转录产物中扩增出cyc-linG2cDNA,亚克隆至双顺反子真核表达载体pIRESneo中获得pIRES-G2重组质粒,基因转染SGC-7901细胞,G418筛选阳性克隆,免疫蛋白印迹杂交方法检测cyclinG2蛋白表达情况,平板克隆形成能力和四甲基噻唑蓝(MTT)比色法对转染后细胞的增殖活性进行分析。结果:成功构建包含cyclinG2基因真核重组表达载体pIRES-G2;转染pIRES-G2的SGC-7901细胞克隆的增殖活性明显下降。结论:cyclinG2基因转染后SGC-7901细胞体外增殖能力下降。     

乙肝病毒与原发性肝癌

业已证实,乙肝病毒(HBV)慢性感染和肝细胞癌在流行病学上密切相关。HBV DNA的克隆和应用分子生物学技术进一步明确了乙肝病毒与肝细胞癌之间的相互作用。一、HBV DNA顺序被整合在肿瘤细胞的DNA中。这种整合在肝癌发生中的作用机理为:(1)最近在某一肿瘤研究中表明,整合可发生于与类固醇激素爱体基因相同的基因中;(2)整合部位,尤其在第11对染色体短臂的13带     

乙肝病毒与原发性肝癌

业巳证实,乙肝病毒(HBV)慢性感染和肝细胞癌在流行病学上密切相关。HBV DNA的克隆和应用分子生物学技术进一步明确了乙肝病毒与肝细胞癌之间的相互作用。一、HBV DNA顺序被整合在肿瘤细胞的DNA中。这种整合在肝癌发生中的作用机理为:(1)最近在某一肿瘤研究中表明,整合可发生于与类固醇激素爱体基因相同的基因中;(2)整合部位,尤其在第11对染色体短臂的13带     

RNA干扰hTERT基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的:探讨RNA干扰hTERT(人端粒酶逆转录酶)基因对人喉鳞状细胞癌的治疗作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2.将shRNA质粒分别转染人喉癌Hep-2细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在Hep-2细胞及瘤体内的表达;以MTT法观察质粒对Hep-2细胞增殖的抑制作用;以蛋白印迹法(Western blot法)检测Hep-2细胞中hTERT蛋白的表达;以免疫组化SP法检测裸鼠瘤体内hTERT蛋白的表达.结果:pshRNA1、pshRNA2转染Hep-2细胞及pshRNA1转染瘤体后,共聚焦显微镜下见大量的癌细胞表达绿色荧光,hTERT蛋白表达明显下降.细胞受pshRNA1、pshRNA2转染后,其生长活性受到明显抑制.体内抑瘤实验表明,与空质粒载体组(pshRNA4)和生理盐水组相比,pshRNA1组移植瘤生长明显受到抑制.结论:表达shRNA的、hTERT基因特异的真核表达质粒能有效转染体内、外喉鳞癌细胞,并可有效抑制人喉鳞癌细胞的生长,为今后应用RNA干扰基因治疗喉癌提供重要的实验参考.     

携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

Obtaining estimates for the ages of all the protein-coding genes and most of the ontology-identified noncoding genes of the human genome,assigned to 19 phylostrata

Following Liebeskind et al [1], we have attempted to find consensus ages for the protein-coding and the noncoding genes of the human genome, using publicly-available ortholog databases. For each database separately, we determined its age estimate for the genes it listed, determining this by identifying the earliest ortholog for the gene in question. We assigned these ages to 1 of the 19 major phylostrata defined by Domazet-Loso and Tautz [2], 2 of which were further subdivided. From these various estimates, we found the modal value if 1 was present, defining this as the consensus age for the gene. For the genes where no consensus value could be found, we recorded the median value of the age estimates across the databases interrogated. We present a resource that lists the age, as so defined, of every one of the 19,660 protein-coding genes and of 5,981 of the 16,528 non–protein-coding genes of the human genome, the age being the time when the gene was accreted to the evolving human genome. We calculate the number of genes that accreted to the genome, epoch by epoch, and consider the rate at which they accreted.     

WWOX 抑癌基因研究进展

WWOX 基因定位于染色体16q23.3-24.1,在卵巢癌、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌及其他肿瘤中检测到其杂合性缺失及染色体重排.该基因位于染色体普通脆性位点16D, 包含9个外显子,编码414个氨基酸相对分子量为46 000大小的蛋白.原发肿瘤组织及细胞系的研究证明该基因为肿瘤抑制基因,其失活可能导致肿瘤的发生,基因敲除实验证实了上述假设.WWOX可能和c-Jun, TNF, p53, p73, AP-2γ,及E2F-1等相互作用而发挥凋亡作用.目前对于该基因是否为肿瘤抑制基因仍存在不同观点,随着研究结果的积累,WWOX基因的功能会日渐明了,并对肿瘤的诊断、治疗和预防产生积极的影响.     

超声造影参数在甲状腺癌诊断中的应用价值及与病灶组织中癌细胞恶性生物学特征的相关性

目的探究超声造影参数在甲状腺癌诊断中的应用价值及与病灶组织中癌细胞恶性生物学特征的相关性。方法选取117例接受超声造影检查的甲状腺结节患者,根据细针穿刺活检结果判断结节良恶性,其中良性76例作为对照组,恶性41例作为研究组。对比2组超声造影参数[曲线下面积(AUC)、达峰时间(TTP)、平均通过时间(MTT)、峰值强度(Peak)]、病灶组织中血管新生基因表达量[血管内皮生长因子(VEGF)、中枢性粘液表皮样瘤(c-met)、缺氧诱导因子α(HIF-α)]、侵袭基因表达量[趋化因子受体4(CXCR4)、特异结合蛋白1(SATB1)、金属蛋白酶解离素9(ADAM9)]、增殖基因表达量[蛋白磷酸酶4调节亚基1(PP4R1)、靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)、线粒体促凋亡蛋白(Smac)]及自噬基因表达量[Beclin1蛋白(Beclin1)、磷酸酶张力蛋白样同源物(PTEN)、小ras同源蛋白Ⅰ(ARHⅠ)],探究超声造影参数对甲状腺癌的诊断价值,及与病灶组织中血管新生、增殖、侵袭及自噬基因表达的相关性。结果研究组AUC、TTP、Peak、MTT均低于对照组(P<0.05);超声造影参数联合诊断甲状腺癌的AUC为0.894,大于超声造影各参数单一诊断,联合诊断的最佳敏感度为80.49%,特异度为85.53%。研究组VEGF、c-met、HIF-α基因表达量均高于对照组(P<0.05);研究组PP4R1、Smac基因表达量低于对照组,TPX2基因表达量高于对照组(P<0.05);研究组CXCR4、SATB1、ADAM9基因表达量高于对照组(P<0.05);研究组Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表达量低于对照组(P<0.05)。甲状腺癌患者超声造影参数AUC、TTP、Peak、MTT与病灶组织中VEGF、c-met、HIF-α、TPX2、CXCR4、SATB1、ADAM9基因表达量存在负相关关系,与PP4R1、Smac、Beclin1、PTEN、ARHⅠ基因表达量存在正相关关系(P<0.05)。结论超声造影对甲状腺癌具有较高的诊断价值,且其参数与病灶组织中血管新生基因、侵袭基因、增殖基因及自噬基因表达量存在密切相关性,有助于评估癌细胞恶性生物学特征,指导临床制定针对性治疗方案。     

Cox-2和Survivin基因在非小细胞肺癌中的表达及相关性的研究

目的:探讨Cox-2和Survivin基因在非小细胞肺癌中的表达及相关性。方法:利用S-P免疫组化技术检测84例肺癌组织及49例癌旁正常肺组织的Cox-2和Survivin蛋白表达水平,分析Cox-2和Survivin表达与肺癌分级、分期、分型和转移的关系及两者的相关性。结果:Cox-2基因在非小细胞肺癌阳性率为67·9%(57/84),Survivin的阳性率为59·5%(50/84),两者的表达与患者年龄、吸烟史、肿瘤大小、分化程度及TNM无关(P>0·05);在非小细胞肺癌组织中Cox-2与Survivin基因的表达呈正相关(P<0·05,r=0·914)。结论:Cox-2与Survivin在组织中均有较高的阳性表达,两者表达具有相关性,两者可能存在共同的激活机制,构成抑制非小细胞肺癌细胞凋亡的多种途径。     

Myc族癌基因与食管癌相关性的研究

目的　通过检测食管癌组织中myc族癌基因的扩增情况探讨myc族癌基因与食管癌发生、发展及预后的关系。方法　聚合酶链反应 (PCR)测定。结果　myc族癌基因的阳性扩增率 5 5 .0 % (11/2 0 )。其过表达与肿瘤分化程度、浸润范围、淋巴结转移、临床病理分期方面在统计学上有差异 (P <0 .0 5 ) ,而与病人年龄、肿瘤部位在统计学上无差异性 (P >0 .0 5 )。结论　myc族癌基因的过表达与食管癌的生物学行为有关。有可能为食管癌病人的防治及预后判定提供新的方法。     

热休克对H22细胞膜HSP70蛋白及其mRNA水平的影响

将IL-2或/和IFN-γ基因体内转染腹腔巨噬细胞(MΦ),其表达的基因产物能提高MΦ的细胞毒活性,并诱导MΦ分泌TNF、IL-1和NO等抗肿瘤免疫介质.激发机体的非特异性免疫功能而产生抗肿瘤效应,特别是IL-2和IFN-γ基因联合转染MΦ,其表达的基因产物既能使MΦ产生更强的细胞毒活性并分泌高水平的TNF、IL-1和NO,又能激活脾CTL细胞,从而激发机体的非特异性和特异性免疫功能,产生更强的快同抗肿瘤效应.结果表明,IL-2和IFN-γ基因转染MΦ较单基因转染具有更强的抗瘤效应     

NOEY2基因对人乳腺癌细胞体外生长的影响

目的：构建NOEY2基因真核表达载体。研究其对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的影响。方法：RT-PCR获得目的基因编码区,经T/A策略克隆后,再亚克隆至pcDNA3,获得真核表达载体。用lipofectAMINE辅助转染MDA-MB-231细胞,经G418长期筛选而获得稳定转染细胞克隆。Western印迹检测NOEY2蛋白水平的表达。通过记录生长曲线和流式细胞分析术观察转染细胞的生长和细胞周期变化。结果：NOEY2真核表达载体pcDNA3/NOEY2-CR构建成功。被稳定转染该载体的MDA-MB-231细胞有明显NOEY2蛋白表达,而对照细胞无表达。NOEY2转染细胞的生长抑制率可达46.3%,在细胞周期改变上可见明显的S期分数和G2/M期分数下降,而G0/G1期比例上升。结论：NOEY2基因转染对体外培养的人乳腺癌细胞生长具有一定的抑制作用。支持其人微言轻一个抑癌基因的推测,本研究为进一步探索NOEY2作为治疗基因的价值创造了条件。     

成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法促进化疗后造血功能恢复的实验研究

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5′、3′端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两次包装,病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10~6CFU/ml)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后,分泌G-CSF达168U/ml,Southern分析表明hG-CSF基因已整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中,Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在NIH3T3-G-CSF细胞的表达。将NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内,能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。     

XRCC1基因G28152A多态与肺癌风险的研究

背景与目的 :研究碱基切除修复基因XRCC1基因G28152A单核苷酸多态与肺癌风险的关系。材料与方法 :以病例_对照研究方法 ,采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性法检测肺癌病例(n=149)和按性别、年龄频数匹配的正常对照(n=157)XRCC1基因G28152A多态 ,分析各基因型与肺癌易感性的关系。 结果 :肺癌患者中 ,XRCC1基因28152AA突变基因型频率为15.4 % ,高于对照组7.6 % ;此基因型个体发生肺癌风险是其他基因型个体的2.2倍(95 %CI1.06～4.61)。 结论 :XRCC1基因G28152A多态可能在肺癌发生中起一定作用。