亲和层析法纯化系统性红斑狼疮特异性 60 KD Ro/SSA抗原

目的：建立亲和层析法纯化Ro／SSA自身抗原系统中60KD组分的方法。方法：从猪脾提ENA(可提取核抗原)，以硫酸铵沉淀、离子交换层析进行初步纯化。挑选单纯抗60 KD SSA抗体阳性的病人的血清，制备亲和层析柱。用ELISA法检测所制备的抗原。结果：60 KD SSA抗体阳性标准血清ELISA检测为阳性，Sm和RNP、Jo-1、Scl-70的标准抗血清为阴性。结论：该方法可获得高纯度的抗原，可用于ELISA检测等目的。     

结核分枝杆菌16KD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究

目的：纯化获得结核分枝杆菌重组16KD蛋白，并评价其在血清学诊断方面的应用价值。方法：应用亲和层析方法纯化结核分枝杆菌重组16KD蛋白，应用ELISA方法检测220例血清中的抗结核抗体。结果：结核分枝杆菌重组16KD蛋白以包涵体形式表达，以48名正常人血清0D492＋2S为正常限值，57例PPD阳性血清，47例菌阳结核患者血清和68例菌阴结核患者血清阳性检出率分别为19．30％、93．62％和82．35％。结论：结核分枝杆菌16KD重组蛋白以包涵体形式高效表达，具有较强的抗原特异性和免疫反应性。     

空肠弯曲菌peblA基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的：克隆空肠弯曲菌peblA基因，构建其原核表达载体；鉴定重组表达产物的免疫原性。方法：PCR扩增空肠弯曲菌peblA基因，构建pET-28a（＋）-peblA表达载体。转化E coli BL21（DE3）后诱导表达，用SDS—PAGE鉴定表达产物。采用Ni—NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEBl。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEBl免疫反应性，双向免疫扩散试验鉴定rPEBl免疫家兔的抗血清效价。结果：所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99．9％，转化E coli BL21（DE3）后，表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33％左右，纯化后获得纯度为96％的重组蛋白。Western blot证实rPEBl能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEBl血清的双向免疫扩散效价为1：16。结论：成功地构建了高效表达载体pET-28a（＋）-peblA，并获得rPEBl，所表达的rPEBl具有良好的免疫原性和免疫反应性，为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

抗结核分支杆菌相关抗原单克隆抗体的制备及荧光抗体染色方法的建立

目的：制备抗结核分支杆菌的特异单克隆抗体，经纯化标记荧光后，建立直接荧光抗体染色方法用于痰标本的检测。方法：采用常规方法制备单克隆抗体。分泌单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选采用ELISA法，确认采用免疫印迹法。单克隆抗体的纯化采用饱和硫酸铵粗提，Sephadex G-50层析纯化。单抗纯化后采用透析法标记异硫氰酸荧光素，初步应用于临床痰涂片的检测。结果：经筛选获得4株单克隆抗体杂交瘤细胞株。ELISA检测小鼠腹水单克隆抗体效价达到1：6400～1：12800。免疫印迹实验表明4株单抗均为抗结核杆菌38KD蛋白单抗，其中两株产生较强的免疫反应条带。单抗纯化后标记异硫氰酸荧光素，建立直接荧光抗体染色方法，对41份结核病患者的痰标本进行检测，阳性率为90．24％，与抗酸染色法比较，直接荧光抗体染色方法敏感性明显高于抗酸染色法（P〈0．05）。结论：制备抗结核杆菌38KD蛋白的单克隆抗体，并建立直接荧光抗体染色方法，初步应用于临床痰涂片检测中，对于辅助诊断结核病具有一定价值。     

hDaXX与12型腺病毒E1B55KD癌蛋白在体内外的结合反应

目的：研究12型糖尿病(Adenovirus 12,Ad12)E1B 55KD癌蛋白（Ad12E1B 55KD）打破hDaxx与急性早幼粒细胞性白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein,PML）在细胞核共定位的机制。方法：构建hDaxx原核细胞表达质粒pQE30/hDaxx，并在大肠杆菌（E.coli）BL21中诱导表达，用镍-氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖加以纯化。通过体内外共免疫沉淀反应，Western blot方法研究hDaxx与Ad12E1B55KD直接结合反应。结果：质粒qQE30/hDaxx在E.coli BL21中成功诱导表达了hDaxx,其N端有6个组氨酸分子附着（6His-hDaxx）.Wetern blot结果显示hDaxx在体内外与Ad12E1B 55KD发生直接结合反应。结论：表达并获得纯化的6His-hDaxx,hDaxx能在体内外与Ad12E1B55KD直接结合。     

粉尘螨浸液的凝胶分析与免疫活性测定

目的：研究粉尘螨浸液的变应原成分及其活性。方法：取实验室人工培养的粉尘螨，制备粉尘螨浸液，以Sephadex G-75、Sephadex G-200凝胶柱层析，收集各管洗脱液进行皮肤试验。结果：粉尘螨浸液经Sephadex G-75柱层析后，洗脱液的A值呈现双峰，能引起皮肤红晕或风团的洗脱液主要位于两峰之间接近第1峰处；经Sephadex G-200柱层析后呈3峰，能引起皮肤红晕或风团的洗脱液主要位于两峰之间接近第2峰处。结论：具有免疫学活性的粉尘螨变应原位于第1峰、第2峰及两峰之间，是免疫诊断和治疗所需组分。     

风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表达、纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌（H．pylori）NCTC11637菌株36kDa（OMP36）外膜蛋白基因原核表达系统，探索研制H．pylorl疫苗的新途径。[方法]培养和收集H．pylori NCTC11637菌株，提取基因组DNA，PCR扩增目的基因片断。将其克隆到T载体并测序，再将目的基因克隆入PET32a（＋），构建重组表达载体PET32a—OMP36。转化E．coli BL21后舢诱导表达，经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白。[结果]测序分析表明。插入的基因片断为987bp，表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为36kDa。并显示具有良好的抗原性。SDS—PAGE检测表明，表达量占细菌总蛋白的37％。镍亲和层析纯化率约92％。Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性。[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP36kDa的编码基因，其表达产物0MP36有望成为新的Hp疫苗候选分子，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

风疹病毒糖蛋白2-核蛋白优势抗原表位原核可溶性融合表达与血清学诊断研究

目的利用原核系统对风疹病毒E2-C(糖蛋白2-核蛋白)融合蛋白优势抗原表位肽段进行表达和纯化,开发用于临床检测风疹病毒特异性抗体的抗原。方法通过生物信息学预测E2-C优势抗原表位,根据原核系统表达特点进行序列优化,全基因合成获得风疹病毒E2-C优势片段核酸序列,构建pET-DsbC(二硫键异构酶)-E2-C融合表达载体,在原核系统内进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的抗原性。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-E2-C经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测80份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-E2-C蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达75%(60/80),阴性检出率为100%,初步验证DsbC-E2-C优势抗原表位融合蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论获得融合蛋白DsbC-E2-C在大肠杆菌中高表达,高纯度重组蛋白抗原性和特异性比较强,利用其建立的Ig M捕获ELISA方法,可开发试剂盒用于检测风疹病毒的早期感染。     

海南省东北部地区某类就诊患者莱姆病抗体检测结果分析

目的 了解海南省东北部地区人群莱姆病感染状况,为临床医生诊断莱姆病提供参考,为本省莱姆病的流行病学调查提供可靠的理论依据。 方法 收集海南省东北部地区三家医院1 334例有关节症状和(或)神经症状的患者血清,采用两步法检测莱姆病抗体,使用间接免疫荧光法(indirect fluorescent antibody test,IFA)初筛血清, 对IFA检测阳性血清用免疫印迹法(Western blot,WB)确证。 结果 IFA法筛查海南省东北部地区1 334例患者莱姆病抗体阳性60例,阳性率4.50%。海口、文昌和琼海地区的三家医院该类就诊患者莱姆病抗体阳性率分别为4.25%、1.40%和8.28%(IFA)。三家医院阳性率比较差异有统计学意义(χ²=25.640,P<0.05)。按不同性别、年龄分组海南省东北部地区三家医院莱姆病抗体阳性率比较差异均无统计学意义(χ²=2.306,P>0.05; χ²=1.015,P>0.05)。 WB法确证莱姆病抗体阳性28例,其抗体以31 KD的外膜蛋白A、33 KD-36 KD外膜蛋白B、39 KD膜脂蛋白、41 KD鞭毛蛋白和60 KD热休克蛋白抗体为主。 结论 海南省东北部地区存在人群感染莱姆病,应加强当地疾病预防和监测。     

中国莱姆病螺旋体PD91重组OspC的鉴定和抗原性检测

目的 重组中国莱姆病螺旋体PD91外膜蛋白C(OspC)并在大肠埃希菌中表达，用于早期莱姆病诊断的研究。方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增出PD91外膜蛋白C基因，定向克隆到表达载体PET-llD，构建重组质粒PET-llD-ospC。用PCR、限制性内切酶分析及序列测定等方法鉴定重组质粒。用Western Blot检测其抗原性。结果 OspC基因被正确克隆到表达载体PET-llD中。序列测定结果证实与国外已报道的序列存在一定的差异。OspC具有强抗原性。结论 该项研究为国内莱姆病的早期特异性诊断的研究奠定了基础。     

贝氏柯克斯体重组抗原P1表达纯化及胶体金免疫层析方法的建立

目的制备贝氏柯克斯体的重组外膜蛋白P1,并建立一种快速检测贝氏柯克斯体抗体的胶体金免疫层析方法。方法利用贝氏柯克斯体主要的表面蛋白P1的良好免疫原性和免疫反应性,对已构建的表达P1抗原的重组工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达P1重组蛋白,通过蛋白纯化、复性、浓缩等过程获得目的蛋白。纯化的P1重组抗原包被硝酸纤维素膜,胶体金标记SPA,建立检测贝氏柯克斯体抗体的免疫层析方法,评价该方法的特异性、灵敏性、稳定性及应用性。结果纯化后获得分子质量(Mr)为52000的目的蛋白,纯度为94%。建立了快速检测贝氏柯克斯体特异性抗体的方法,对阳性参照样本检测,目测灵敏度可达1∶105,采用金标仪半定量检测灵敏度可达116ng/ml;对94份鼠血清和90份健康人血清检测,无阳性检出;对布鲁氏菌、普氏立克次体、军团菌、土拉弗朗西斯菌等传播途径和临床特征相似的病原抗体进行检测,未发生交叉反应。结论利用重组抗原建立的贝氏柯克斯体抗体胶体金免疫层析方法具有较好的敏感性和特异性,可用于传染病快速筛查。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白原核可溶性表达

目的在原核系统内获得结核分枝杆菌Rv3425蛋白可溶性表达并进行纯化,Western-blot技术初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法将Rv3425核酸编码序列克隆至融合表达载体p ET-Dsb C中,然后进行融合蛋白Dsb CRv3425表达并实现亲和纯化,用Western-blot分析其抗原性和特异性。结果 Rv3425基因在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和纯化的Dsb C-Rv3425蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论Dsb C-Rv3425蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,具有较好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

HIV多抗原位点串联基因的表达及活性鉴定

目的在原核表达载体系统中对HIV—1／2型外壳蛋白多个抗原位点串联基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法人工合成含HIVgp41的2个抗原位点、gp120的3个群的各3个抗原位点及gp36的2个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，利用固化金属离子配体亲和层析技术纯化表达蛋白．利用逐渐降低尿素浓度透析法使目的蛋白复性。用免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一条约32KD的蛋白带．与设计分子量相符。免疫印迹、ELISA试验显示该表达蛋白可与HIV患者血清较好结合．而与其它患者血清无交叉反应。结论成功构建了由HIV外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经一步纯化后纯度较高．并具有良好特异性和活性。     

细胞穿透肽CCL融合蛋白的构建与表达

目的评估细胞穿透肽CCL融合蛋白构建的可能性。方法将CCL6 PEP 6XHis构建至pABP质粒，然后提取pABP CCL6 PEP质粒进行人胚肾HEK293细胞转染表达，以及CCL6 PEP 6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽CCL融合蛋白。将CCL6 PEP 6XHis Tag 基因经PCR扩增、接入T 载体、克隆、培养，并提取质粒进行测序鉴定，所得序列与目的基因一致。成功将CCL6 PEP 6XHis基因构建至哺乳动物细胞表达载体pABP 中，经质粒提取和酶切鉴定，电泳结果显示，HindⅢ + XbaⅠ切出约430 bp的条带，符合预期，酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性，表明纯化得到的目标蛋白带有hisx6标签。结论细胞穿透肽CCL融合蛋白能够人工构建，并通过真核细胞进行表达。     

PTD-Lmp-3融合蛋白的纯化、表达和鉴定

目的构建融合蛋白PTD-Lmp-3的表达质粒,并进行诱导表达、纯化及鉴定。方法利用基因重组技术构建pET43.1a-PTD-Lmp-3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni2＋-NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白。结果成功构建了表达质粒pET43.1a-PTD-Lmp-3,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在融合蛋白的相应位置PTD-LMP-3约为22 kD,可溶性分析发现融合蛋白主要以上清形式存在,纯化后得到了目的蛋白。Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性。结论成功构建了PTD-Lmp-3的重组表达载体,使融合蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

恙虫病东方体56-kDa型特异性抗原基因的表达及抗原性鉴定

目的表达和鉴定恙虫病东方体特异性诊断抗原,为恙虫病诊断试剂的研发提供实验基础。方法从恙虫病病例血液标本中提取恙虫病东方体核酸,PCR扩增4个不同基因型56-kDa特异性抗原基因,目的基因被定向克隆到原核表达载体pET-30a (+),在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定和镍柱纯化,用患者恢复期血清进行免疫印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的抗原性。结果从4个不同基因型别的病例血清中扩增出Karp、Kato、TA763和Gillima的部分56-kDa抗原基因,片段大小为1 350 bp～1 410 bp,分别表达并纯化出分子量大小为56. 59 kDa～58. 44 kDa的4个重组蛋白,重组的4种蛋白均与恢复期病例血清有良好的反应。结论成功表达出恙虫病东方体4个型特异性抗原蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性。