粒-巨噬细胞集落刺激因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本研究以内皮细胞培养液（Endo-M）培养小鼠骨髓内皮细胞,探讨粒-巨噬系集落刺激因子（rmGM-CSF）对骨髓内皮细胞增殖的影响。用Endo-M培养小鼠骨髓内皮细胞,通过Wright-Giemsa染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型;加入不同浓度的GM-CSF,通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期,观察GM-CSF对内皮细胞体外扩增的影响。结果表明：Endo-M诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落,vWF检测呈阳性;集落形成率检测及MTT法测定均证实GM-CSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用;生长周期检测结果显示,GM-CSF处理组的细胞进入S期的比率为9.3%,而对照组为2.1%,说明GM-CSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂,促进细胞增殖;比较第1代和第4次传代后细胞的生长曲线,两者无明显差别,说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能。结论：GM-CSF对内皮细胞的增殖具有促进作用,经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变。     

微血管内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向心肌样分化及其移植的可行性

背景:骨髓间充质干细胞通过再生心肌细胞在心肌损伤性疾病治疗方面突显较大潜力,但目前仍未找到一种理想的诱导方式.目的:探讨微血管内皮细胞诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的潜能,并分析其移植的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内移植实验,于2008-07/2009-02在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:清洁级二三月龄健康雄性SD大鼠16只,购自重庆医科大学实验动物中心方法:孔径0.4 μm的transwell小室,置入培养板孔构成双室培养体系.取SD大鼠1只,Ficoll密度梯度+贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,组织块法分离培养微血管内皮细胞.培养瓶中融合至50%生长良好的微血管内皮细胞,每3 d更换培养液,收集更换液过滤即制成条件培养液.体外实验分为4组:直接接触组、双室培养组、条件培养液组、培养液对照组,观察各种培养条件对骨髓间充质干细胞的心肌诱导效应.取SD大鼠15只建立心肌梗死模型,冠状动脉结扎后第6天任取1只大鼠明确心肌梗死建模是否成功,其余大鼠随机分为细胞移植组8只、模型对照组6只.造模1周后,细胞移植组将在双室模型中与微血管内皮细胞共培养5 d的骨髓间充质干细胞调整浓度为109L-1通过鼠尾静脉缓慢注入1 mL,模型对照组予等量DMEM,观察4周.主要观察指标:体外实验通过免疫荧光染色检测心肌标志物Tnl、α-actin的表达;采用心电图、荧光镜检、苏木精-伊红染色等方式评价体内移植的安全性及可行性.结果:直接接触组、双室培养组、条件培养液组部分骨髓间充质干细胞心肌标志物Tnl、α-actin阳性表达,荧光镜下胞浆发绿光(或红光),前2组诱导率基本相似(P>0.05),且均明显高于条件培养液组(P<0.05);培养液对照组细胞未向心肌样细胞分化.细胞移植后两组大鼠均存活良好,未出现死亡及恶性心律失常,4周后细胞移植组心脏冰冻切片荧光镜检显示心肌内有少量胞核蓝染的细胞,提示干细胞成功归巢,结合苏木精-伊红染色,归巢细胞位于心肌梗死灶周边区域,呈单个或小团聚集;而模型对照组心肌切片未见胞核蓝染的细胞.结论:微血管内皮细胞能够通过旁分泌途径诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,经微血管内皮细胞预处理过的骨髓间充质干细胞移植入大鼠体内是安全的,可成功归巢到大鼠心肌梗死灶及周边区.     

骨髓内皮细胞分泌的抑制CFU—F生长的因子

为探讨骨髓微环境中内皮细胞调节造血的可能机制,本实验研究了骨髓内皮细胞无血清条件培养液（ＢＭＥＣ－ＣＭ）及其不同分子量组分对骨髓成纤维祖细胞（ＣＦＵ－Ｆ）生长的作用。在体外培养条件下,收集人和小鼠纯骨髓内皮细胞无血清条件培养液,应用连续超滤技术从其中制备出分子量〉１０ｋＤ,３－１０ｋＤ和〈３ｋＤ三种组分,进行骨髓ＣＦＵ－Ｆ集落形成实验,检测这些条件培养液及其超滤组分的作用。结果显示,人和小鼠骨髓内     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10μg/L转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约 60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约 70%的细胞呈阳性,RT-PCR 显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和 CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

骨髓基质细胞对血管内皮细胞生长及微血管形成的影响

目的研究骨髓基质细胞（BMSCs）在体外对血管内皮细胞生长及对微血管形成的影响。方法体外分离培养成人BMSCs和脑血管内皮细胞，分为共培养组、培养液组和对照组，观察BMSCs对脑血管内皮细胞增殖及微血管网状结构形成的影响。结果培养液组和共培养组对内皮细胞的增殖和微血管形成均有促进作用，共培养组的作用更为明显。结论BMSCs在体外促进内皮细胞的生长及微血管的形成。     

骨髓内皮细胞条件培养液促进小鼠胚胎干细胞向造血分化

为观察骨髓内皮细胞条件培养液(BECM)和(或)细胞因子(VEGF SCF EPO)对小鼠胚胎干细胞(ESC-D3细胞)生成造血干／祖细胞的促进作用，先将ESC-D3细胞形成4天胚状体(Day 4 embryoid body,4dEB)，再诱导4dEBs生成造血干／祖细胞。实验分4组，第1，2和3组分别为BECM VEGF SCF EPO，BECM和VEGF SCF EPO组，第4组为自发分化对照组。检测各组造血干／祖细胞特异抗原、造血转录因子表达以及造血集落的形成。结果显示，BBCM和(或)细胞因子诱导生成的细胞均表达造血干／祖细胞抗原(c-kit,Sca-1,Thy-1和CD34)和造血转录因子(c—myb，SCL和β-H1)基因mRNA，培养后可产生HPP-CFC和BFU-E。从诱导ESC-D3细胞生成造血干／祖细胞的数量和生成的集落总数看，BBCM联合细胞因子组诱导效率均显高于单用组和对照组。结论：骨髓内皮细胞条件培养液能显促进胚胎干细胞早期造血分化，且骨髓内皮细胞条件培养液与细胞因子联合时效果更强。     

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的:观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用。方法:实验于2004-04/08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成。实验动物为日本大耳白兔。制备标准培养液和条件培养液,体外分离兔长骨骨髓基质细胞,标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞,3d后半量换液,其后每两三天换液1次。当细胞融合80%,用25g/L胰蛋白酶消化,以1∶2传代培养。应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态,采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线。以5×107L-1细胞接种到96培养板中,培养24h后,更换标准培养液、条件培养液,继续培养至第5天及第10天,经处理,每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液,37℃孵育40min,每孔加1mol/L氢氧化钠50μL终止反应,在490nm波长测定各孔吸光度值,以U/L表示细胞碱性磷酸酶相对活性。将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组,去除培养液,磷酸盐缓冲液pH7.3清洗,10g/L多聚甲醛固定1h,行常规VonKossa染色观察矿化结节形成。实验数据进行配对资料t检验。结果:①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好,细胞接种后1d少量细胞贴壁,呈圆形,2d可见贴壁细胞增多,3d有少量细胞呈纺锤形,6d后见细胞呈多种形态,且形成分散的集落,其间混有少量圆形透光度较好的细胞。1周后细胞集落迅速增多,且集落中的细胞明显增多,近12～14d集落融合成片,细胞排列有一定的方向性,呈旋涡状排列,表现为类成纤维样细胞集落生长。②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组(P<0.05),条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高(P<0.05),而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异。③条件培养组VonKossa染色强阳性,细胞间连接处可见大量黑色沉积物,证实有大量矿化结节的存在。而在标准培养液组未见黑色沉积物,VonKossa染色阴性。结论:骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化

背景:骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议.目的:体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力.方法:分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化.另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周:单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照.结果与结论:小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达.小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34.提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力.     

兔骨髓基质细胞在条件培养液中向成骨细胞转化的特征

目的：观察不同类型的培养液环境对骨髓基质细胞向成骨细胞转化的诱导作用。方法：实验于2004-04／08在哈尔滨医科大学附属一院实验中心完成。实验动物为日本大耳白兔。制备标准培养液和条件培养液，体外分离兔长骨骨髓基质细胞，标准培养液和条件培养液体外培养骨髓基质原代细胞，3d后半量换液，其后每两三天换液1次。当细胞融合80％，用25g／L胰蛋白酶消化，以1：2传代培养。应用倒置相差显微镜逐日观察体外培养的骨髓基质细胞的形态，采用常规24孔培养板计数法测定第3代细胞在标准培养液及条件培养液培养条件下的细胞生长曲线。以5&;#215;10^7L^-1细胞接种到96培养板中，培养24h后，更换标准培养液、条件培养液，继续培养至第5天及第10天，经处理，每孔加100μL碱性磷酸酶底物溶液，37℃孵育40min，每孔加1mol／L氢氧化钠50μL终止反应，在490nm波长测定各孔吸光度值，以U／L表示细胞碱性磷酸酶相对活性。将传代培养至第10天的标准培养液和条件培养液细胞分作2组，去除培养液，磷酸盐缓冲液pH7．3清洗，10g／L多聚甲醛固定1h，行常规VonKossa染色观察矿化结节形成。实验数据进行配对资料t检验。结果：①骨髓基质细胞在标准培养液中生长良好，细胞接种后1d少量细胞贴壁，呈圆形，2d可见贴壁细胞增多，3d有少量细胞呈纺锤形，6d后见细胞呈多种形态，且形成分散的集落，其间混有少量圆形透光度较好的细胞。1周后细胞集落迅速增多，且集落中的细胞明显增多，近12～14d集落融合成片，细胞排列有一定的方向性，呈旋涡状排列，表现为类成纤维样细胞集落生长。②条件培养液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用，条件培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点均显著高于标准培养液组（P〈0．05），条件培养组液随培养时间延长其碱性磷酸酶活性显著增高（P〈0．05），而标准培养液组碱性磷酸酶活性在各时间点无显著差异。③条件培养组VonKossa染色强阳性，细胞间连接处可见大量黑色沉积物，证实有大量矿化结节的存在。而在标准培养液组未见黑色沉积物，VonKossa染色阴性。结论：骨髓基质细胞在体外条件培养液中可明显增强其形成矿化组织的能力。     

人骨髓基质细胞体外培养修复骨缺损

目的建立一种新型、简易的人骨髓成骨细胞体外培养方法.方法以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养,并在不同培养液中进行培养,用倒置显微镜、扫描电镜、组织化学染色等方法进行观测.结果人骨髓基质细胞16d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞4～5d即可传代.在条件培养液中2周形成多层结构,并出现细胞结节,碱性磷酸酶(ALP)染色阳性,钙染色阳性.结论本实验所获人骨髓基质细胞具有成骨细胞的形态特征和生物学特征.     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

骨髓内皮细胞产生造血抑制因子

本研究探讨骨髓内皮细胞分泌的造血抑制因子在扩增造血祖细胞中的作用并初步探讨其作用机制。收集无血清骨髓内皮细胞条件培养液 (BMEC CM) ,离心超滤 ,获得 >1 0kD和 <1 0kD的组分 ,以观察BMEC CM原液及其 >1 0kD和 <1 0kD组分对CFU GM及HPP CFC的增殖作用的影响 ;检测骨髓内皮细胞及BMEC CM中抑制因子的表达 ,用抗体中和实验检测BMEC CM中的抑制因子对造血集落的抑制活性 ;用膜杂交法检测抑制因子联合造血刺激因子扩增造血细胞时增殖与分化相关基因的改变。结果表明 :①BMEC CM ,>1 0kD及 <1 0kD组分分别加入集落培养体系 ,BMEC CM对CFU GM及HPP CFC的生成无明显影响 ,>1 0kD组分增加CFU GM及HPP CFC的生成 ,<1 0kD组分抑制CFU GM及HPP CFC的生成。②BMEC CM ,>1 0kD及 <1 0kD组分分别加入骨髓细胞液体培养体系培养 2 4小时后 ,BMEC CM组CFU GM明显减少 ,HPP CFC显著增加 ;>1 0kD组分组CFU GM明显增加 ,HPP CFC无显著改变 ;<1 0kD组分组CFU GM及HPP CFC均明显减少。③小鼠骨髓内皮细胞表达MIP 2 ,MIP 1α ,MSP ,TGF β,TNF α,IFN γ及Tβ4。BMEC CM中存在有MIP 2 ,MIP 1α ,MSP ,TGF β ,TNF α和Tβ4。④抗体中和实验结果表明在BMEC CM中的TGF β ,MSP ,MIP 1α,IFN γ和Tβ4有明显抑制活性。⑤Tβ4     

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液体外扩增胚胎及成体造血干/祖细胞的差异及其机制探讨

本研究比较小鼠骨髓内皮细胞条件培养液(mBMEC-CM)联合FL和TPO对卵黄囊和骨髓造血干／祖细胞体外生长的影响，并对其机制进行探讨。取卵黄囊和骨髓单细胞悬液，对照组中加入含10％FBS的DMEM，实验组分别加入10％mBMEC-CM，FL(5ng/ml)和TPO(2ng／ml)，10％mBMEC-CM复合FL和TPO培养24小时后进行集落培养，计数CFU-GM和HPP-CFC的集落数。应用Atlas cDNA Expression Array对卵黄囊和骨髓造血细胞表达的细胞因子受体进行检测。结果表明：mBMEC-CM能扩增卵黄囊和骨髓CFU-GM和HPP-CFC，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM扩增骨髓CFU-GM和HPP-CFC的能力明显强于其扩增卵黄囊CFU-GM和HPP-CFC的能力。检测到小鼠卵黄囊及骨髓造血细胞存在差异表达的细胞因子受体；卵黄囊造血细胞表达PDGF-Rβ，PDGF-Ra和促肾上腺皮质激素释放因子受体，而在骨髓造血细胞中未检测到上述受体的表达；在骨髓造血细胞中表达的IFN-γR，GM-CSFR，多巴胺D2受体和卵泡刺激素受体则未在卵黄囊造血细胞中检测到mRNA的表达。结论：mBMEC-CM能支持卵黄囊和骨髓造血祖细胞的体外扩增，其与FL和TPO联合后扩增能力明显增强；mBMEC-CM对骨髓造血祖细胞表现出更强的扩增作用。检测到卵黄囊和骨髓造血细胞之问存在差异表达的细胞因子受体，提示mBMEC-CM对胚胎及成体造血细胞扩增中存在的差异可能与两种造血细胞存在差异表达的细胞因子受体有关。     

移植GM—CSF基因修饰的骨髓细胞对小鼠造血恢复的影响

探索粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的骨髓细胞促进照射鼠骨髓移植后造血功能恢复的可行性。通过基因转移造血细胞进行骨髓移植的小鼠模型动态观察移植鼠外周血细胞数量、肝脾及骨髓形态学,CFU-S,CFU-GM及血清GM-CSF活性的变化。结果表明,实验组小鼠外周血白细胞与中性粒细胞计数,CFU-S及脾脏CFU-GM明显高于对照组(P<0.05),而各组间骨髓CFU-GM计数无显著性差异(P>0.05);组织学显示实验小鼠肝脾造血组织明显增多,而各组间骨髓象改变不大,并且血清GM-CSF活性也较对照组明显升高(P<0.01)。结论提示,给γ射线照射小鼠移植GM-CSF基因修饰的骨髓造血细胞能显著加快造血恢复的过程。     

糖尿病对骨髓干细胞血管新生潜能的影响

目的研究糖尿病对骨髓干细胞产生血管生长因子的能力以及向内皮细胞分化能力的影响。方法从糖尿病肥胖大鼠（实验组）和非糖尿病健康大鼠（对照组）各20只分离采集骨髓干细胞进行培养,并检测培养后骨髓干细胞的生存率、培养液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度、以及骨髓干细胞向内皮细胞的分化率。结果实验组经培养3d后骨髓干细胞的生成率为（30.1±2.4）%,与对照组（31.9±3.8）%相比,无显著性差异（P〉0.05）;实验组经培养7d后骨髓干细胞的生成率为（18.5±3.1）%,与对照组（20.4±1.9）%相比,无显著性差异（P〉0.05）。实验组经培养3d后培养基上清液中VEGF的浓度（134.8±27.5）ng.mL^-1显著低于对照组（189.1±25.6）ng.mL^-1（P〈0.01）;实验组经培养7d后培养基上清液中VEGF的浓度为（282.7±25.2）ng.mL^-1,显著低于对照组（370.2±40.1）ng.mL^-1（P〈0.01）。实验组经培养7d后骨髓干细胞的内皮细胞分化率为（14.7±4.5）%,显著低于对照组（32.8±5.6）%（P〈0.01）。结论糖尿病可以导致骨髓干细胞产生血管生长因子的能力下降以及向内皮细胞分化的能力受损,这将可能导致用自身骨髓干细胞诱导血管新生的能力降低。     

小鼠异基因骨髓移植γ线清髓性照射对骨髓内皮龛的损伤研究

本研究探索异基因骨髓移植清髓性γ线照射预处理对受鼠骨髓内皮的损伤程度。体外培养小鼠骨髓单个核细胞,经5-7天检测其表面标记、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1鉴定,并行CFSE标记。分析正常组、清髓性照射组、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）移植组及照射联合EPC移植组小鼠外周血中白细胞变化、骨髓内皮的改变及CFSE标记EPC的骨髓内分布。结果发现,培养细胞鉴定证实为CD31＋CD133＋CD45low/-,且具有吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1能力。小鼠清髓照射后外周血白细胞迅速减少,与正常组相比,有显著差异（p〈0.05）。照射后3天,骨髓中大量出血,内皮细胞和基底膜间连接被损坏。清髓照射后输注CFSE标记EPC,18小时后小鼠骨髓中可见CFSE＋细胞,其细胞量是正常小鼠单纯EPC输注组的58倍（p〈0.05）。结论：移植清髓照射预处理引起严重骨髓内皮龛损伤,该损伤驱动外源性EPC的归巢。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

两种分离培养小鼠骨髓来源内皮祖细胞方法的比较

目的 比较密度梯度离心法及全骨髓培养法分离培养内皮祖细胞的差异。方法 取4周雄性近交系C57BL/6J小鼠骨髓,分别使用密度梯度离心法及全骨髓培养法培养,观察细胞贴壁情况和细胞形态,并行DiI acLDL及FITC UEA I双染、vWF、eNOS及细胞表面标志检测。结果 密度梯度离心法培养细胞可形成典型铺路石样改变及形成血管样结构;而全骨髓培养法贴壁细胞形态多样,较多呈长梭形铺展生长,部分细胞呈类圆形及纺锤形。比较两种方法培养细胞摄取DiI acLDL、结合FITC UEA I双阳性率以及vWF、eNOS及细胞表面标志表达阳性率,差别均有统计学意义（P〈005）。应用密度梯度离心法,随着培养时间延长,表达CD34、CD133及FLk 1细胞逐渐增多（P〈005）。结论 密度梯度离心法及全骨髓培养法在EGM 2MV培养体系下均可培养出内皮祖细胞,但密度梯度离心法较全骨髓培养法培养的内皮祖细胞纯度高。