卵巢癌患者腹水来源树突状细胞强化CIK细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用

目的:建立诱导卵巢癌患者腹水来源的树突状细胞(DC)的方法,并观察腹水DC对CIK细胞在体外杀伤卵巢癌细胞系SKOV3的作用。方法:分离腹水单核细胞后诱导DC,分离患者外周血单个核细胞诱生CIK细胞,通过流式细胞仪分析免疫表型,并以LDH释放法检测DC对CIK细胞在体外杀伤卵巢癌细胞株的作用。结果:除外周血单核细胞来源DC表达CD86较高外,其他表面分子及异基因刺激能力在不同来源的DC间没有差异。负载SKOV3抗原的DC能诱导出CIK细胞对SKOV3细胞系最强的细胞毒杀伤力,负载HO8910的DC与单纯DC次之,且两者无差异。CIK组细胞毒性最低。结论:卵巢癌患者腹水中含有大量的免疫活性细胞,其中更有丰富的DC前体细胞,可诱导出成熟有功能的DC。冻融肿瘤细胞获取全细胞抗原法可以在不明确肿瘤特异抗原的情况下使用,负载于DC后可以诱导出CIK细胞的特异性杀伤。     

冻融抗原致敏的树突细胞对裸鼠人卵巢癌移植瘤治疗作用的研究

目的 :研究冻融抗原致敏的树突细胞 (DC)对裸鼠人卵巢癌移植瘤的治疗作用。方法 :联合应用粒性白细胞与巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)及白介素 4 (IL 4 )从正常足月产妇分娩后新生儿脐血中培养出DC ,以人卵巢癌细胞系 3AO细胞冻融抗原激活DC ,测定其诱导的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)对 3AO的杀伤活性 ;CTL预防性接种于裸鼠皮下 ,观察裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生率 ,以DC激活的CTL治疗裸鼠人卵巢癌移植瘤并观察治疗效果。结果 :体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激T淋巴细胞增殖 ,其诱导的CTL对细胞系 3AO具有显著的杀伤作用 ,在效靶比为 4 0 :1、2 0 :1、10 :1、5 :1时 72h杀伤率平均分别为 90 .1%、67.4 %、4 0 .4 %、17.8%。DC激活的CTL能预防裸鼠人卵巢癌移植瘤的发生 (预防组 16.6% ,对照组 10 0 % ,P <0 .0 0 1) ,并能抑制移植瘤生长 ,对照组、治疗组移植瘤的大小分别为 (5 .6± 1.1)cm3 、(2 .7± 0 .78)cm3 (P <0 .0 1)。结论 :人卵巢癌细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC可作为一种抗癌疫苗在免疫治疗卵巢癌患者中发挥重要作用     

脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌免疫

目的 :研究脐血来源树突状细胞 (DC)的体外扩增及诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应。方法 :①从脐血中分离单个核细胞 (MNCs)后 ,获得单核细胞 (Mo)。粒单集落刺激因子 (GM -CSF)和白介素 4(IL - 4)诱导分化扩增 ,培养 7天后应用流式细胞仪进行表型分析。②诱导单核细胞分化的第 3天加入人卵巢癌细胞株 3A0的冻融抗原 ,共培养 4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC ;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养 3天 ,获得细胞毒T淋巴细胞 (CTL) ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测CTL及上清液对人卵巢癌细胞株 3A0、人胚肾细胞株 2 93T(对照细胞 )、人肝癌细胞株HCCC - 9810的细胞毒作用。结果 :①脐血来源Mo在GM -CSF和IL - 4作用下 ,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CD1a、CD80 (B7- 1)、CD86 (B7- 2 )、HLA -DR、CD83。②DC可负载并递呈肿瘤抗原 ,激活同种异体T淋巴细胞 ,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对卵巢癌细胞 3A0有特异性杀伤、抑制作用 (P <0 .0 5 )。结论 :脐血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC ,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应。     

人脐血来源树突状细胞体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌免疫应答

目的:研究脐血来源树突状细胞(DC)体外扩增及诱导特异性抗宫颈癌细胞的免疫效应。方法:自人脐血分离单核细胞诱导DC,制备宫颈癌细胞系CaSki冻融物作为抗原负载DC。ELISA法检测成熟DC上清中IL-12的含量,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的CTL对宫颈癌细胞CaSki和HeLa的杀伤作用。结果:与未经抗原负载的DC相比,抗原负载的DC刺激同种异体T细胞增殖和IL-12分泌的能力均有提高(P<0·05),激活的CTL对CaSki细胞有特异性杀伤,而此CTL对HeLa细胞无特异性杀伤。结论:宫颈癌细胞CaSki冻融抗原负载DC激活的CTL可诱导出特异性杀伤宫颈癌细胞的免疫效应。     

6B11抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的　用 6B1 1抗独特型微抗体体外负载树突状细胞 (DC) ,以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法　分离培养HLA -A2 健康人外周血树突状细胞 ,培养过程中用 6B1 1微抗体负载 ,无关抗原F (ab)’2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态 ;流式细胞仪检测DC表面分子表达 ;3 H -TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖 ;51 Cr 6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果　培养的树突细胞有典型形态 ,CD80、CD86、HLA -DR等表面分子呈高表达 (分别为 6 5 %、 86 2 %、 93 7% ) ;6B1 1微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖 ,而且其诱导的CTL细胞对HLA -A2 、OC1 6 6 - 9 卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤 ,结论　 6B1 1抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC1 6 6 - 9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞 ,为进一步研究 6B1 1微抗体对卵巢癌免疫治疗作用提供了依据     

树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫的实验研究

目的 观察人外周血树突状细胞(Dendritic cells,DC),体外能否诱导抗卵巢癌免疫应答。方法 用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)从健康女性外周血分化诱导DC,以源于人卵巢癌细胞系HO-8910的肿瘤抗原粗提物冲击致敏DC,将致敏DC、同源淋巴细胞和卵巢癌细胞共育,观察负载抗原DC体外诱导淋巴细胞对HO-8910细胞的杀伤作用,同时设不同类型肿瘤细胞(Eca-109和PC-12)作为对照。MTT法测定细胞杀伤活性。结果 经卵巢癌细胞HO-8910肿瘤抗原脉冲致敏的DC能诱导淋巴细胞特异性地杀伤卵巢癌细胞。结论 用GM-CSF、IL-4和TNF-α从人外周血诱生的DC能从卵巢癌细胞HO-8910冻融物有效递呈抗原并诱导出高效而特异的抗卵巢癌免疫反应。     

6811抗独特型微抗体负载树突状细胞对卵巢癌细胞系细胞杀伤作用的体外研究

目的 用6811抗独特型微抗体体外负载树突状细胞(DC)，以期诱导出抗原特异性的抗肿瘤免疫反应。方法 分离培养HLA-A2 健康人外周血树突状细胞，培养过程中用6811微抗体负载，无关抗原F(ab)2负载及未负载组为对照。光镜、电镜下观察树突的形态；流式细胞仪检测DC表面分子表达；^3H-TdR掺入法测DC刺激自体T细胞增殖；^51Cr6h释放试验测激活的T细胞对卵巢癌细胞系的杀伤。结果 培养的树突细胞有典型形态，CD80、CD86、HLA-DR等表面分子呈高表达(分别为65％、86．2％、93．7％)；6811微抗体负载的DC不仅能刺激自体T细胞的增殖，而且其诱导的CTL细胞对HLA-A2 、OC166-9 卵巢癌细胞系HOC1A有特异性的杀伤，结论 6811抗独特型微抗体模拟卵巢癌抗原OC166-9负载树突状细胞在体外可以诱导出抗原特异性的细胞毒T细胞，为进一步研究6811微抗体对卵巢癌免疫治疗作用提供了依据。     

双特异抗体COC183B_2×anti-CD28对卵巢上皮癌细胞杀伤效力的研究

目的 :检测双特异抗体 (bispecificantibody ,BsAb)COC183B2 ×anti CD2 8在体外介导预激活的外周血单个核细胞 (PBMC)对卵巢上皮癌细胞系SKOV3的杀伤效力。方法 :在大肠杆菌中对用基因工程方法构建的COC183B2 ×anti CD2 8进行诱导表达 ,用ELISA方法测定表达产物与卵巢癌抗原和CD2 8抗原结合的活性后 ,与SKOV3和预激活的PBMC共孵育。 6h后用非放射性细胞毒分析试剂测定预激活的PBMC对SKOV3细胞毒性作用 ,并在镜下观察SKOV3的形态学改变。结果 :ELISA结果显示 ,COC183B2 ×anti CD2 8可与卵巢癌抗原和CD2 8抗原双向结合 ;细胞毒性试验显示 ,在体外COC183B2 ×anti CD2 8能介导预激活的PBMC特异杀伤SKOV3细胞 ;4h时镜下可见玫瑰花环形成 ,12h可见肿瘤细胞溶解。结论 :COC183B2 ×anti CD2 8可在体外介导预激活的外周血淋巴细胞对卵巢上皮癌细胞特异性杀伤     

负载宫颈癌肿瘤裂解物的树突状细胞诱导的CTL杀伤效应

目的:利用树突状细胞(DC)递呈肿瘤抗原的生物学特性,提高细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对宫颈癌细胞的杀伤活性。方法:联合应用重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导培养宫颈癌患者外周血DC,以宫颈癌组织肿瘤相关抗原(TAA)激活DC,诱导异体T细胞增殖分化为CTL,以MTT法测定CTL增殖活性及其对宫颈癌Hela细胞株的特异性杀伤活性。结果:宫颈癌患者外周血来源DC负载宫颈癌肿瘤裂解物后,可促进CTL增殖,诱导产生的CTL对宫颈癌细胞具有高效而特异的杀伤率,且显著高于异种肿瘤细胞(P<0.05)。结论:DC能递呈宫颈癌肿瘤抗原,诱导产生抗原特异和高效的CTL,提示负载肿瘤裂解物的DC,具有为宫颈癌患者进行特异性免疫治疗的临床应用前景。     

树突状细胞与卵巢癌细胞的融合及体外抗肿瘤作用的研究

目的 :比较脐血及以卵巢癌患者外周血来源的树突状细胞 (DC)的特点 ,研究DC 卵巢癌融合瘤苗的体外免疫应答效果。方法 :从脐血及卵巢癌患者外周血中诱导扩增DC ,从数量、形态、细胞表面标志及刺激增殖活性方面进行比较。体外培养卵巢癌患者癌细胞 ,将其与脐血DC在聚乙二醇 (PEG)介导下融合 ,活化自体T细胞 ,MTT法检测杀伤效果。结果 :体外诱导卵巢癌患者外周血DC ,每 2 0ml血能够获得 (0 .6～ 1.6 )× 10 6 个细胞 ;体外诱导脐血DC ,每 2 0ml血能够获得 (1.8～ 3.5 )× 10 6 个细胞 ,二者有明显差异 (P<0 .0 5 )。卵巢癌患者外周血DC在混和淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)中显示了更为显著的刺激增殖活性。两者表达高水平的MHCII类分子和共刺激分子。经脐血DC 自体卵巢癌融合细胞活化的T细胞 ,对卵巢癌细胞株细胞的杀伤没有增加 ,而增强了对自体卵巢癌细胞的杀伤力。结论 :由脐血诱导可以获得更多数量的DC。脐血DC与自体卵巢癌细胞融合 ,能使肿瘤相关抗原有效提呈 ,激活T细胞 ,使它成为抗原特异性CTL ,有效杀伤自体癌细胞     

survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3生长的抑制作用

目的观察survivin反义RNA对卵巢癌细胞株SKOV3的生长抑制作用及其对裸鼠皮下种植瘤成瘤能力的影响。方法构建能在真核细胞中稳定表达survivin反义RNA的载体pcDNA3-SVVas,应用基因重组技术,将pcDNA3-SVVas经脂质体lipofectam ine 2000介导转染卵巢癌细胞株SKOV3(SKOV3/SVVas),同时以空载体pcDNA3转染SKOV3细胞(SKOV3/neo)作为对照;绘制细胞生长曲线,采用免疫组化、RT-PCR和流式细胞仪检测SKOV3/SVVas、SKOV3/neo和SKOV3细胞survivin mRNA及蛋白的表达和细胞凋亡率。将24只裸鼠随机分为3组,每组8只,分别将SKOV3/SVVas、SKOV3/neo、SKOV3细胞接种于裸鼠皮下,观察成瘤情况及肿瘤体积变化。结果与SKOV3细胞比较,SKOV3/SVVas细胞增殖能力明显降低;SKOV3/SVVas细胞survivin蛋白阳性细胞率及survivin mRNA表达量分别为(37.5±1.0)%、0.407±0.022,与SKOV3细胞的(81.2±0.4)%、0.793±0.042和SKOV3/neo细胞的(80.4±0.8)%、0.734±0.039比较,差异均有统计学意义(P<0.01);SKOV3/SVVas细胞凋亡率显著增加,为(27.4±9.6)%,与SKOV3和SKOV3/neo细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3/SVVas组裸鼠成瘤率降低,出现目检可见肿瘤的平均时间延长为(14.0±1.0)d,与SKOV3/neo组的(6.1±0.8)d和SKOV3组的(5.8±0.9)d比较,差异有统计学意义(P<0.01);与SKOV3、SKOV3/neo组比较,SKOV3/SVVas组裸鼠肿瘤生长速度缓慢,肿瘤体积的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论稳定表达的survivin反义RNA能够有效抑制SKOV3细胞生长,降低survivin的表达,诱导SKOV3细胞凋亡;转染survivin反义RNA的SKOV3/SVVas细胞在裸鼠皮下的成瘤能力降低。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

脂质体介导的DCC基因对卵巢上皮性癌细胞生长的抑制作用

目的探讨脂质体介导的DCC基因对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系SKOV3细胞生长的抑制作用。方法通过目的基因克隆、载体构建技术,将DCC基因重组于pcDNA3·1(+)质粒中,构建pcDNA3·1(+)-DCC质粒,并通过脂质体介导,将此质粒转染入SKOV3细胞中(即SKOV3/DCC细胞)。实验分为3组,DCC基因转染组(SKOV3/DCC组)、空载体转染组(SKOV3/Neo组)和空白对照组(SKOV3组)。RT-PCR技术和免疫组化染色方法检测3组细胞中DCCmRNA和蛋白的表达,并观察细胞集落形成率、生长速度、细胞周期等生物学行为变化。结果RT-PCR技术和免疫组化染色方法检测显示,外源性DCC基因通过基因重组及脂质体介导,已整合于SKOV3细胞并获稳定表达。SKOV3/DCC组细胞的生长速度较SKOV3和SKOV3/Neo组减慢,分别比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。SKOV3/DCC组细胞克隆数为(38±8)个,分别与SKOV3和SKOV3/Neo组[分别为(192±8)、(186±10)个]比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。细胞周期分析显示,SKOV3/DCC组,G1期细胞占78·0%,S期细胞占5·3%,与SKOV3/Neo组(分别为20.0%、3.2%)比较,差异有统计学意义(P<0·01)。电镜观察显示,SKOV3/DCC组细胞超微结构出现生长受到抑制的特征。结论DCC基因可明显抑制卵巢癌细胞生长,可能在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。     

卵巢浆液性癌B7-H4的表达及临床病理意义

目的:探讨B7-H4在卵巢上皮性肿瘤浆液性癌中的表达及其临床病理意义。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及免疫组织化学染色的方法检测6例良性卵巢上皮性肿瘤、10例交界性卵巢上皮性肿瘤、41例卵巢浆液性癌、5例内膜样癌、2例透明细胞癌和10例粘液性癌标本中B7-H4 mRNA及蛋白表达,并结合临床病理资料对其中41例卵巢浆液性癌中B7-H4蛋白的表达进行分析。结果:B7-H4 mRNA在74例卵巢上皮性肿瘤中均有表达,B7-H4蛋白在良性卵巢上皮性肿瘤、交界性卵巢上皮性肿瘤、恶性卵巢上皮性肿瘤中的表达阳性比例分别为2/6、6/10、52/58,恶性标本阳性率明显高于非恶性标本,差异有统计学意义(P<0.05);58例恶性卵巢上皮性癌标本中浆液性癌、内膜样癌、透明细胞癌、黏液性癌的B7-H4蛋白阳性比例分别为41/41、5/5、2/2、4/10,前三种病理类型B7-H4蛋白阳性率明显高于最后一种,且差异有统计学意义(P<0.05);41例卵巢浆液性癌标本中B7-H4蛋白阳性细胞比例在<10%,>10%~50%,>50~80%,>80~100%4组中的分布差异无显著性(P>0.05),且其蛋白表达与临床分期及病理分级有关(P<0.05),而与患者年龄、腹水细胞学、淋巴结转移无关(P>0.05)。结论:B7-H4在卵巢浆液性癌的高表达及其与临床分级分期的关系,提示其可能与肿瘤发生发展有关,可为卵巢恶性肿瘤诊断及治疗提供靶位点。     

Study of cellular immunity response of mB7-1 gene transfected mouse ovarian cancer cell line and its tumorigenecities in vivo

Ovariancarcinomaremainsthefourthleadingcauseofcancerdeathsinthefemalepopulationandcarrieswithitadisproportionatelyhighmortalityratecomparedwithotherfemalepelviccancers .Althoughgreatapproacheshavebeengotteninsurgery ,chemotherapyand/orradiotherapy ,noobviousincreaseinfive yearsurvivalrateinthisneoplasmcouldbeseen[1] .Itisreasonableforgynecologiststosearchfornewtreatmentstrategyaswellasperfectthecurrenttherapeuticprocedures .Grossinvestigationshaveshowedthatsomeapproachesmaybeparticularlyeffect…     

KDM5B基因在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌耐药能力的影响

目的:检测组蛋白去甲基化转移酶KDM5B(JARID1B/PLU-1)在正常卵巢、卵巢癌组织及细胞株中的表达,以及其对卵巢癌细胞株耐药能力的影响。方法:RT-q PCR法检测KDM5B在36例卵巢癌、15例正常卵巢、6例术后化疗耐药复发患者组织及卵巢上皮细胞株IOSE和5株卵巢癌细胞中的表达情况;构建p MSCVpuro-KDM5B过表达质粒和p GIPZ-sh1、p GIPZ-sh2干扰质粒,并筛选得到稳定过表达的SKOV3和稳定干扰的Caov3细胞株,RT-q PCR和Western blot法鉴定调控效果;用浓度梯度递增的顺铂处理SKOV3过表达和Caov3干扰细胞株,CCK-8法检测顺铂半抑制浓度(IC50)变化。结果:RTq PCR结果示,正常卵巢组织中KDM5B相对表达量(1.950±0.3003)低于卵巢癌组织(4.924±0.2989),差异有统计学意义(t=5.909,P0.0001)。KDM5B表达量与卵巢癌患者的FIGO分期、病理分级、转移和耐药发生明显相关,与患者年龄、CA125水平不相关。6例复发患者中,5例KDM5B表达明显升高(P0.001)。KDM5B的mRNA和蛋白水平在卵巢上皮性细胞株IOSE中最低,在卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910、ES-2、A2780、Caov3中表达逐渐增加。RT-q PCR结果示,SKOV3过表达组的KDM5B表达量为对照组的27.4倍,Caov3干扰sh1和sh2组分别为对照组的0.38和0.41倍,Western blot也显示过表达和干扰有效。用浓度梯度递增的顺铂处理Caov3细胞株,KDM5B表达量随顺铂浓度增加而逐渐升高;检测SKOV3细胞株KDM5B过表达组IC50为3.666(95%CI为3.067~4.382)μg/ml高于对照组[1.676(95%CI为1.553~1.810)μg/ml],Caov3细胞株干扰sh1组和sh2组分别为3.359(95%CI为2.875~3.925)μg/ml、2.881(95%CI为2.49~3.324)μg/ml,均低于对照组[6.972(95%CI为6.182~7.864)]。结论:组蛋白去甲基化转移酶KDM5B在卵巢癌中表达升高,并且具有促进卵巢癌细胞株耐药的作用。     

ERCC1基因与卵巢上皮癌细胞铂类耐药相关性探讨

目的 检测切除修复交叉互补1（ERCC1）基因在人卵巢上皮癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3／DDP及其亲本细胞株SKOV3中的表达,探讨ERCC1基因在卵巢上皮癌顺铂耐药中的意义以及有效沉默ERCC1基因能否有效逆转SKOV3／DDP细胞对DDP耐药。方法 于2013-2014年在南方医科大学采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测 ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3／DDP及SKOV3细胞中的表达。人工构建3个靶向沉默ERCC1基因的短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,慢病毒载体法转染至SKOV3／DDP细胞,RT-PCR和Western印迹法检测ERCC1基因水平并挑选沉默效果最佳的表达载体。RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染后SKOV3／DDP细胞中ERCC1基因的表达,CCK-8法检测转染细胞对DDP的耐药性。结果 SKOV3／DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量明显高于SKOV3,差异有统计学意义(P<0.01)。稳定转染ERCC1 shRNA后的SKOV3／DDP细胞,ERCC1的mRNA及蛋白的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞活性检测提示特异性沉默ERCC1基因能增加SKOV3/DDP 细胞对顺铂的敏感性(P<0.05)。结论 ERCC1基因在SKOV3／DDP细胞中的表达明显升高,有效沉默ERCC1 基因能有效逆转SKOV3/DDP细胞对DDP耐药,增加卵巢上皮癌DDP耐药细胞对DDP的敏感性,为卵巢上皮癌耐药的治疗提供新靶点。     

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制卵巢癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 :研究抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因对人卵巢癌细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达的抑制作用 ,探讨卵巢癌基因治疗的新途径。方法 :人卵巢癌细胞SKOV3高表达VEGF ,将抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因真核表达载体 (pcDNA3 RZ)转染人卵巢癌细胞SKOV3,经G4 18筛选获得阳性细胞克隆 ,RNA斑点杂交检测核酶基因是否在细胞中表达。采用免疫组化、间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜荧光定量法及流式细胞仪结合间接免疫荧光检测转染前后细胞VEGF的表达情况。结果 :转染pcDNA3 RZ组细胞VEGF表达明显降低。结论 :抗人VEGF发夹状核酶基因真核表达载体可有效抑制卵巢癌细胞SKOV3中VEGF的表达 ,有望成为治疗卵巢癌的一种新方法。     

Study of cellular immunity response of Mb7-1 gene transfected mouse ovarian cancer cell line and its tumorigeneeities in vivo

Objective: To investigate the cellular immunity response in vitro and the tumorigenecities in vivo of mB7-1 gene transfected murine ovarian cancer cell line. Methods: mB7-1 gene was transfected into the NuTu-19 cell line by retrovirus vector, and the expression of mB7-1 gene was confirmed by flow cytometry(FCM).NuTu-19/neo and NuTu-19/mB7-1 cells were injected subcutaneously into syngeneic Fischer 344 rats respectively, and their tumorigenecities were recorded. Proliferation indices of lymphocyte were assayed after syngenieic mixed tumor-lymphocyte cultures(MTLCs). The lysis activity of CTL toward tumor cells was determined using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay. Results: Successful transfection of mB7-1 gene into NuTu-19 cell line was comfirmed with FCM. In vitro study showed that there was no obvious changes in cell growth of gene transfected cell line, compared with the cell line NuTu-19. NuTu-19/mB7-1 cells could induce more effective proliferation of effector lymphocytes( P ＜ 0.05). The lysis activity of CTL activated by NuTu-19/mB7-1 was stronger than that of NuTu-19/neo ( P ＜ 0.01). Tumor sizes were smaller in the NuTu-19/mB7-1 receptance syngeneic Fischer 344 rats compared with those in the control group. Conclusion: mB7-1 genetically modified ovarian cancer cells could induce the cellular immunity response in vitro and the tumorigenecitiy of NuTu-19 cells was decreased after inoculation with the experimental vaccine.     

B7-H4 is over-expressed in early-stage ovarian cancer and is independent of CA125 expression

OBJECTIVE: This study characterizes the expression of the novel biomarker B7-H4 in ovarian cancer tissue, normal ovaries, and benign ovarian tumors, and evaluates its relationship to CA125. METHODS: Ovarian tissue lysates from 251 patients with ovarian carcinoma were assessed for the levels of B7-H4 and CA125 by ELISA assays. For comparison, ovarian tissues from patients with benign ovarian tumors (n=43) and patients with normal ovaries (n=32) were tested. The marker concentrations were correlated with CA125 expression, clinicopathological variables, and patient outcome. RESULTS: Using a cut-off based on the 95th percentile of B7-H4 or CA125 concentration in the control group, B7-H4 was over-expressed in 48% of patients with stage I cancer, 55% of patients with stage II cancer, and 67% of patients with late stage cancer. CA125 was elevated in 31% patients with early stage cancer. B7-H4 was elevated in tumors of 30 patients with early stage cancer that were negative for CA125. The combination of B7-H4 and CA125 identified 56 early stage cancer patients (65%) as positive. Correlation of marker expression to clinical outcome showed that high B7-H4 levels were correlated with poor prognosis. However, the effect was not significant when outcome was adjusted for other clinicopathological variables. CONCLUSION: B7-H4 expression was low in normal ovaries and in benign tumors while half of early stage and two-thirds of late stage cancers over-expressed B7-H4. The data are consistent with previous observations and support further investigation of B7-H4 in the detection of early stage ovarian cancer either alone, or in combination with CA125.