嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

目的:观察嗅鞘细胞条件培养液(OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(ACM)对受损海马神经元的保护作用。方法:分别采用2种胶质细胞条件培养液预处理受损海马神经元(谷氨酸诱导损伤),对比其对受损海马神经元活力、凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响。结果:与谷氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P0.01),ACM组神经元活力增高(P0.05);与OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P0.05)。与谷氨酸组相比,ACM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度降低(P0.05),OECCM组明显降低(P0.01);OECCM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度低于ACM组(P0.05)。结论:OECCM和ACM均可明显提高受损海马神经元活力、降低凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度,OECCM的保护作用优于ACM。     

移植神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅鞘细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的:探讨大鼠脊髓损伤后神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅神经鞘细胞移植对脊髓损伤后细胞凋亡及促进神经功能恢复的作用。方法:实验于2003-09/2004-04在广东医学院实验动物中心完成,SD大鼠48只,雌雄不限,体质量240～260g。随机分为3组:基因修饰组,嗅鞘细胞移植组,脊髓损伤组,每组16只。均首先行大鼠脊髓损伤造模。基因修饰组和嗅鞘细胞移植组分别移植神经生长因子、脑衍生神经生长因子修饰的嗅鞘细胞和单纯嗅鞘细胞,脊髓损伤组不做治疗。移植后12周,采用免疫组织化学法和原位末端标记法对损伤区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测,主要观察bcl-2(细胞凋亡抑制基因),bax和fas(细胞凋亡诱导基因)阳性表达的情况评估经基因修饰和未经基因修饰的单纯嗅鞘细胞对脊髓神经凋亡的抑制及诱导作用。结果:48只大鼠均进入结果分析。①原位末端标记法检测结果:基因修饰组细胞凋亡数低于嗅鞘细胞移植组,脊髓损伤组最高。②免疫组织化学结果:Bcl-2蛋白表达的顺序为基因修饰组>嗅鞘细胞移植组>脊髓损伤组(20.79±6.40,13.54±3.66,9.34±2.12,P<0.05);Fas,Bax蛋白表达的顺序均为脊髓损伤组>嗅鞘细胞移植组>基因修饰组[(24.98±4.32,40.48±2.05),(18.92±4.74,25.54±3.82),(11.78±3.81,16.87±3.30),(P<0.05)]。结论:单纯移植嗅鞘细胞其存活时间与分泌有限。神经生长因子和脑衍生神经生长因子是神经营养因子的主要成员,用神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰嗅鞘细胞后可提高嗅鞘细胞的生存时间和提高分泌神经营养因子功能,移植后具有抑神经细胞凋亡的作用。     

嗅鞘细胞移植对脊髓半横断大鼠骨骼肌的影响

背景:现有研究表明嗅鞘细胞移植可促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的恢复,但多数实验是以动物行为学评分作为观察指标.目的:实验拟进一步观察嗅鞘细胞移植后6周脊髓半横断损伤大鼠后肢小腿三头肌组织形态学的变化.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-10/2007-03在四川大学华西基础医学与法医学院神经生物学开放实验室完成.材料:清洁级2.5月龄雌性SD大鼠40只,由自四川大学华西医学中心提供.细胞培养过程中使用的阿糖胞苷为ROCHE产品.方法:5只大鼠麻醉后取出脑双侧嗅球,采用差速贴壁与阿糖胞苷抑制相结合的方法分离培养纯化嗅鞘细胞,第14天分别收集培养上清液和密度为1×1010L-1细胞悬液备用.剩余35只大鼠设立两组:正常组5只,不做任何处理;模型组30只,于T11～12节段建立脊髓半横断损伤模型后,又分为5个亚组:8只移植纯化的嗅鞘细胞悬液,6只移植纯化的嗅鞘细胞培养上清液,6只移植未纯化的嗅鞘细胞悬液(主要是嗅神经成纤维细胞),5只移植未纯化的嗅鞘细胞培养上清液,5只移植DMEM/F12培养液.移植量12μL/只,在脊髓半横断损伤上、下各1mm处多点注射移植4μL,同时在半横断处填充的明胶海绵内注入8μL.主要观察指标:移植后6周取左侧后肢小腿三头肌,苏木精-伊红染色观察肌细胞形态变化,图像分析软件测量肌细胞横截面积和直径.结果:[1]正常组肌细胞近似圆形或多边形,多核,核分布于外周.各移植组肌细胞均变小,核深染,其中移植DMEM/F12培养液组变化最为明显.[2]各移植组肌细胞横截面积及直径较正常组均明显减少(P<0.05),其中移植纯化的嗅鞘细胞组减少程度最轻(P<0.05),移植DMEM/F12培养液组减少程度最严重(P<0.05),移植未纯化的嗅鞘细胞、纯化/未纯化的嗅鞘细胞培养上清液3组间无明显差异(P0.05).结论:移植纯化的嗅鞘细胞悬液脊髓半橫断损伤大鼠后肢小腿三头肌萎缩的程度最轻,肌细胞组织学变化最小.     

不同来源嗅鞘细胞修复脊髓损伤的效果比较

背景:研究表明嗅鞘细胞所分泌的细胞黏附分子和神经营养因子具有保护脊髓神经元和促进脊髓轴突再生的效应.目的:比较嗅球及嗅黏膜固有层来源的嗅鞘细胞异体移植修复脊髓损伤的能力.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-06/2008-06在西电集团医院中心实验室完成.材料:随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只,分为实验组(23月龄)和对照组(3月龄),用于嗅鞘细胞的体外培养和纯化;SD大鼠30只随机分为乳鼠嗅球嗅鞘细胞移植组、正常嗅黏膜嗅鞘细胞移植组、对照组,每组10只.方法:30只SD大鼠制造脊髓损伤模型,分别将体外培养的乳鼠和SD大鼠嗅鞘细胞进行脊髓损伤模型的异体移植,对照组不做移植.主要观察指标:术后4,8周,进行BBB神经功能评分,诱发电位,组织病理学观察.结果:实验过程中大鼠死亡7只,各组死亡率大致相同.移植后第4,8周时,乳鼠嗅鞘细胞移植组、正常嗅黏膜嗅鞘细胞组评分差异无显著性意义(P>0.05),均显著高于空白对照组(P<0.001);嗅鞘细胞移植2组评分8周高于4周(P<0.01).术后4周,各组动物均未引出运动诱发电位,移植后8周时,2组嗅鞘细胞移植组动物均可引出运动诱发电位,2组差异无显著性意义(P>0.05),空白对照组动物仍未引出运动诱发电位(P<0.001).移植后8周,2组嗅鞘细胞移植组脊髓损伤区有较多细胞浸润,对照组细胞数目较少.结论:来源于嗅球与嗅黏膜的嗅鞘细胞对脊髓损伤修复均有促进作用,且两者作用无明显差异.     

嗅鞘细胞移植损伤脊髓组织的超微结构变化

背景:脊髓损伤后神经功能难以自行恢复,嗅鞘细胞具有外周性和中枢性两种胶质细胞的成鞘功能,是修复受损神经最有前途的种子细胞.嗅鞘细胞移植到受损脊髓后的组织学和超微结构的变化可能帮助解释嗅鞘细胞发挥修复作用的机制.目的:验证嗅球源性嗅鞘细胞移植对脊髓损伤功能恢复的促进作用,并观察移植的嗅鞘细胞对神经元和轴突组织和超微结构的影响.方法:将已制备脊髓模型的Wistar大鼠随机分为3组,对照组不做任何注射操作,DMEM/F12组注射DMEM/F12培养基,嗅鞘细胞组注射嗅鞘细胞悬液.每周进行肢体活动BBB评分,8周后取脊髓标本进行组织学和免疫组织化学观察,评价脊髓损伤的修复情况,并观察嗅鞘细胞移植对脊髓组织和超微结构的影响.结果与结论:3组动物均出现后肢运动功能的恢复,嗅鞘细胞组优于对照组和DMEM/F12组,在4周后更为明显.组织学观察可见,在嗅鞘细胞组可见有神经纤维通过损伤处.损伤处附近,嗅鞘细胞组脊髓腹侧的神经纤维和神经元形态较好,损伤较轻.而对照组和DMEM/F12组神经纤维和神经元损害严重.嗅鞘细胞组的caspsase.3阳性细胞数少于对照组和DMEM/F12组.超微结构观察可见,嗅鞘细胞组的神经纤维和细胞形态均优于对照组和DMEM/F12组.结果表明嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤修复有明显的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能,对受损神经纤维和神经元有保护作用.     

脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的:运用血清药理学方法观察脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:①实验于2004-10/12在南通大学基础医学院病理生理实验室完成。采用12月龄SD大鼠24只,随机分为2组:对照组和脑益康灌胃组,每组12只,脑益康组以人等效剂量的1.5倍连续10d灌胃,末次灌胃后1h采血,收集脑益康药物血清。收集对照组(灌胃等量生理盐水)血清为对照。②PC12细胞经神经生长因子诱导7d后,用DMEM基础培养基洗2次,DMEM培养基中分别加入100,300,500g/L脑益康中药血清,于37℃培养1h,后加入0.2mmol/L谷氨酸,0.5mmol/L过氧化氢继续培养30min。同时设模型组(造成谷氨酸和过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型)及对照组(对照组大鼠血清,不加谷氨酸和过氧化氢)。③采用四唑盐比色法测定PC12细胞存活率;按由南京建成生物工程公司提供测试盒说明书进行乳酸脱氢酶释放量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性测定。④计量资料差异比较采用ANOVA法。结果:①谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞存活率明显低于对照组(P<0.05,0.01);而乳酸脱氢酶释放量明显高于对照组(P<0.01);谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞丙二醛含量明显高于对照组(P<0.01);而超氧化物歧化酶活性明显低于对照组(P<0.01)。②脑益康药物血清组PC12细胞存活率明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01);而细胞的乳酸脱氢酶释放量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01)。③脑益康药物血清组丙二醛含量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05,0.01);而超氧化物歧化酶活性明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05)。结论:脑益康药物血清能明显减轻谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞的损伤,其机制可能与减少膜脂质过氧化物生成,提高抗氧化酶活性有关。     

嗅鞘细胞移植脊髓损伤大鼠Sema3A及其受体NP-1基因的表达

背景:嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复机制中对神经生长抑制导向因子的研究较少。目的:观察嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤后神经生长抑制导向因子Sema3A及其受体NP-1在RNA水平表达的变化。方法:17只SD大鼠随机分为嗅鞘细胞移植组、DMEM/F12培养液移植组和正常对照组。制作T11～T12水平大鼠脊髓左侧半横断损伤模型,立刻分别注射嗅鞘细胞悬液或等量的DMEM/F12培养液。结果与结论:6周后取横断水平前后两个脊髓节段,用RT-PCR的方法对Sema3A、NP-1的mRNA进行半定量分析。①嗅鞘细胞在大鼠脊髓内仍有大量存活。②Sema3A及NP-1mRNA的量,DMEM/F12培养液移植组明显多于正常对照组(P<0.05),嗅鞘细胞移植组与培养液移植组比较明显下调,且与正常对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。③提示嗅鞘细胞移植有效减少了神经生长抑制导向因子Sema3A及其受体NP-1mRNA的表达。     

移植神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅鞘细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅神经鞘细胞移植对脊髓损伤后细胞凋亡及促进神经功能恢复的作用。方法：实验于2003—09／2004—04在广东医学院实验动物中心完成，SD大鼠48只，雌雄不限，体质量240～260g。随机分为3组：基因修饰组，嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组，每组16只。均首先行大鼠脊髓损伤造模。基因修饰组和嗅鞘细胞移植组分别移植神经生长因子、脑衍生神经生长因子修饰的嗅鞘细胞和单纯嗅鞘细胞，脊髓损伤组不做治疗。移植后12周，采用免疫组织化学法和原位末端标记法对损伤区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测，主要观察bcl-2(细胞凋亡抑制基因)，bax和fas(细胞凋亡诱导基因)阳性表达的情况评估经基因修饰和未经基因修饰的单纯嗅鞘细胞对脊髓神经凋亡的抑制及诱导作用。结果：48只大鼠均进入结果分析。①原位末端标记法检测结果：基因修饰组细胞凋亡数低于嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组最高。②免疫组织化学结果：Bcl-2蛋白表达的顺序为基因修饰组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;脊髓损伤组(20．79&;#177;6．40，13．54&;#177;3．66，9．34&;#177;2．12，P&;lt;0．05）；Fas，Bax蛋白表达的顺序均为脊髓损伤组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;基因修饰组【(24．98&;#177;4．32，40．48&;#177;2．05)，(18．92&;#177;4．74，25．54&;#177;3．82)，(11．78&;#177;3．81，16．87&;#177;3．30)，(P&;lt;0．05)】。结论：单纯移植嗅鞘细胞其存活时间与分泌有限。神经生长因子和脑衍生神经生长因子是神经营养因子的主要成员，用神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰嗅鞘细胞后可提高嗅鞘细胞的生存时间和提高分泌神经营养因子功能，移植后具有抑神经细胞凋亡的作用。     

嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后神经元凋亡的影响

目的:了解嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响,探讨嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的机制。方法:成年动物脊髓半切损伤模型,进行嗅鞘细胞和培养液移植,在伤后1～14d,应用苏木精-伊红和TUNEL法观测神经细胞存活和细胞凋亡变化。结果:脊髓半切后,神经元数目随时间下降。伤侧和对侧分别在伤后1d和2d,出现以神经元为主的凋亡高峰。7d出现以胶质细胞为主的凋亡高峰,14d凋亡下降。嗅鞘细胞移植可明显降低脊髓损伤后神经细胞凋亡,促进神经细胞存活。结论:脊髓损伤后嗅鞘细胞移植有对抗神经细胞凋亡作用。     

黄芪注射液对体外培养嗅鞘细胞增殖及其分泌神经营养因子的影响

背景:单独黄芪注射或嗅鞘细胞移植均可促进多种神经元的存活及脊髓损伤后神经功能的恢复,若联合嗅鞘细胞移植和中药黄芪注射液治疗脊髓损伤,是否可达到更好临床效果?目的:观察黄芪注射液对嗅鞘细胞增埴及其分泌神经营养因子的影响.方法:分离培养新生24 h内SD大鼠嗅鞘细胞并纯化,采用免疫组织化学方法鉴定.取培养至第8天的嗅鞘细胞,种植于多聚赖氨酸包被的96孔板,置于37℃、体积分数5%CO2培养箱饥饿24 h后,加入2mg/L,20mg/L,200mg/L,2 g/L,20 g/L黄茛注射液作用24 h,采用MTT法和流式细胞仪检测黄芪注射液对嗅鞘细胞增殖的影响:采用ELISA法测定培养上清中胶质细胞源性神经营养因子的水平.以血清培养液组为阴性对照.结果与结论:与阴性对照组比较,2,20 mg/L质量浓度黄芪注射液可明显促进嗅鞘细胞增殖(P＜0.05,P＜0.01):不同质量浓度黄芪注射液均增加嗅鞘细胞G1细胞比例,减少S、G2期细胞所占比例,但差异无显著性意义(P＞0.05),但各质量浓度黄芪注射液均显著减少嗅鞘细胞凋亡数量(P＜0.05):2 mg/L质量浓度黄芪能对嗅鞘细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子有显著的促进作用.结果说明黄芪注射液可协同嗅鞘细胞促进脊髓损伤的恢复.