#br# AKT-糖原合成激酶-3β信号通路对SOD1G93A 突变N2a细胞的保护作用

目的 探讨AKT-糖原合成激酶-3β(GSK-3β)信号通路对SOD1^G93A突变N2a细胞的作用及机制。 方法 选取小鼠成神经瘤细胞系N2a,分别转染pEGFP-WT-SOD1和pEGFP-G93A-SOD1质粒,应用Western blotting和免疫荧光染色方法检测AKT、GSK-3β和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在细胞模型中的表达变化。应用RT-PCR和Western blotting技术检测siRNA沉默AKT后GSK-3β和cyclin D1在SOD1突变N2a细胞中的表达变化,通过MTS方法,检测细胞增殖和存活的改变。 结果 与pEGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中AKT及GSK-3β总蛋白在转染后24 h和48 h表达均无明显变化,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1表达均升高。免疫荧光染色结果显示,转染后24 h和48 h,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1在pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均升高。应用siRNA沉默AKT后与对照组相比,在转染后48 h和72 h,AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1蛋白均降低。MTS实验结果显示,在AKT沉默后72 h、96 h、120 h,N2a细胞增殖和活力降低。 结论 SOD1^G93A突变影响N2a细胞中AKT、GSK-3β翻译后磷酸化修饰及cyclin D1的表达,AKT可能通过调控GSK-3β和cyclin D1影响SOD1 ^G93A突变N2a细胞的增殖和存活。     

人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞

 目的：探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体（dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR）对胃癌细胞细胞周期的影响及其分子机制。方法：选用2株人胃癌细胞,分为如下6组：SGC-7901细胞未转染组（US组）、SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组)、SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组)、NCI-N87细胞未转染组（UN组)、NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组)和NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。采用流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测细胞周期素依赖性蛋白激酶2（CDK2）、cyclin D1、Ser9位点磷酸化糖原合成酶激酶3β［p-GSK-3β(Ser9)］、p21和p27蛋白水平。结果：转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现G0/G1期阻滞,CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白水平降低,p21和p27蛋白水平则升高。结论：DNEGFR通过激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低,并降低CDK2蛋白水平,上调p21和p27蛋白水平,最终导致胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。这一结果将为胃癌生物治疗研究提供新思路。     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

蛋白质酪氨酸激酶2通过PI3K/AKT/Gsk3b信号调控Tau磷酸化

目的 探究蛋白质酪氨酸激酶2(protein tyrosine kinase, Pyk2)在学习记忆障碍小鼠模型中的表达及对神经元细胞Tau蛋白磷酸化的影响和分子机制。方法 免疫组化检测APPswe/PS1ΔE9(APP/PS1)双转基因AD和WT小鼠脑组织Pyk2蛋白表达;免疫印迹检测Pyk2、Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8和AT270蛋白表达;免疫印迹检测SHSY-5Y细胞共转染pcDNA6.2-Pyk2-GFP和pcDNA6.2-hTau(2N4R)-V5质粒24h后Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8和AT270蛋白表达;包装PLOK1-Pyk2 shRNA慢病毒,转染SHSY-5Y细胞构建Pyk2敲低细胞系,转染hTau(2N4R)质粒24h后,Western blot检测Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8、AT270、P110α、P110β、P85α、p-P85α、AKT、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、Gsk3β和p-Gsk3β(Ser9)蛋白表达。结果 与...     

特异性ILK siRNA对膀胱癌EJ细胞EMT及移植瘤生长的影响

目的研究整合素连接激酶(ILK)特异siRNA沉默ILK基因对膀胱癌EJ细胞上皮间质转化(EMT)及移植瘤生长的影响。方法用特异性ILK siRNA表达载体p Gensil-1siRNA1质粒和对照质粒p Gensil-1siRNA3稳定转染EJ细胞,实验分为EJ siRNA组、EJ vector组和EJ细胞组;激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架;Western blot检测p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达;细胞免疫荧光检测p-AKT、p-GSK-3β的表达;用免疫荧光检测整合素连接激酶和核糖核酸酶抑制因子在EJ细胞中的共定位;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;建立裸鼠移植瘤模型,肿瘤和肺组织切片HE染色,免疫组化检测瘤组织中ILK、RI、NM23-H1和E-cadherin蛋白的表达;免疫荧光检测p-AKT、p-GSK-3β和CD31蛋白的表达。结果 EJ siRNA组细胞运动能力减弱;EJ siRNA组p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达明显降低(P0.05);MTT法结果提示实验组细胞增殖明显受到抑制;下调ILK通过阻滞G0/G1期抑制细胞增殖;下调ILK抑制膀胱癌EJ细胞移植瘤生长转移。结论特异性ILK siRNA可以改变EJ细胞特性,抑制EMT的发生,引起增殖侵袭能力下降。     

MiR-215-5p经AKT/GSK-3β/Snail信号通路抑制乳头状甲状腺癌增殖、迁移和侵袭

目的探究miR-215-5p对乳头状甲状腺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响以及机制。方法乳头状甲状腺癌TPC1细胞体外转染miR-215-5p mimic后利用MTT实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验检测TPC1细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化;预测并验证miR-215-5p的靶基因,并且在TPC1细胞过表达和低表达miR-215-5p的靶基因后,检测TPC1细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化;利用Western blot检测转染后靶基因的表达水平,AKT和GSK-3β的磷酸化水平,以及Snail的表达水平。结果 miR-215-5p mimic能够显著抑制TPC1细胞增殖、迁移、侵袭能力(P0.05);通过双荧光素酶报告实验验证了miR-215-5p的靶基因为ARFGEF1;低表达ARFGEF1的TPC1细胞增殖、迁移、侵袭能力被显著抑制(P0.05);miR-215-5p mimic可显著抑制过表达ARFGEF1引起的TPC1细胞增殖、迁移、侵袭能力的增加(P0.05);Western blot结果显示miR-215-5p mimic可引起ARFGEF1和Snail表达水平显著降低(P0.05),AKT和GSK-3β的磷酸化水平降低(P0.05),但是miR-215-5p inhibitor和过表达ARFGEF1均可恢复ARFGEF1和Snail表达水平以及AKT和GSK-3β的磷酸化水平。结论 MiR-215-5p通过AKT/GSK-3β/Snail信号通路以ARFGEF1为目标发出信号抑制乳头状甲状腺癌增殖、迁移和侵袭。     

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。     

cyclinD1过表达对子宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖及上皮间质转化的影响北大核心CSCD

目的 探讨cyclin D1过表达对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、分化的影响及其他信号分子的变化情况.方法 采用PCR法扩增cyclin D1基因全长,构建cyclin D1-pcDNA3.1质粒转染人乳头状瘤病毒16阳性的SiHa细胞,筛选cyclin D1稳定过表达细胞株.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blot分别检测转染细胞cyclin D1 mRNA和蛋白表达.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR法和Western blot检测转染细胞CK7、E-cadherin、波形蛋白、Snail基因的mRNA和蛋白表达;采用RT-PCR法检测增殖分化相关基因CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E、Rb、E2F、E6/E7、Ki-67基因的mRNA表达水平.对细胞同步化处理,用RT-PCR法检测细胞周期不同时间点cyclin D1及p21基因的mRNA表达情况.结果 成功构建cyclin D1稳定过表达的G-3细胞株.生长曲线及Ki-67 mRNA升高（P〈0.05）提示G-3细胞增殖速度加快,G-3细胞中波形蛋白、Snail基因和蛋白表达明显增加（均P〈0.05）,E-cadherin、CK7基因和蛋白表达明显降低,提示转染细胞发生了上皮间质转化.cyclin D1过表达后,CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E表达增加,Rb、E2F、E6/E7、p16表达无明显改变,p21与cyclin D1表达趋势基本一致,在细胞周期不同时间点表达存在波动性.结论 转染诱导cyclin D1过表达可促进SiHa细胞增殖和上皮间质转化,这一过程中伴随着CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E基因表达的上调.cyclin D1过表达时,p21表达量也增高,可能通过影响波形蛋白表达参与了对SiHa细胞上皮间质转化的调控.     

Akt/GSK-3β介导高糖上调肾小管上皮细胞Snail1的表达

 目的：观察高糖对原代肾小管上皮细胞Snail1和蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（Akt/GSK-3β）信号通路的影响,探讨糖尿病肾病时Snail1表达的调节机制。方法：原代培养大鼠肾小管上皮细胞（RTECs）,随机分为正常糖对照组、高渗组和高糖组。Western blotting检测不同处理组 RTECs不同培养时点（30 min、2 h、12 h、24 h、48 h和72 h）Snail1、Akt1、GSK-3β、磷酸化Akt（p-Akt,Ser473）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β,Ser9）蛋白的水平。RT-PCR检测Snail1、Akt1和GSK3β mRNA的表达。RTECs以磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002（25 μmol/L）预处理50 min,再与高糖共同培养24 h,Western blotting检测上述指标蛋白的表达。结果：与正常糖对照组比较,高糖组RTECs Snail1和Akt1蛋白和mRNA的表达上调,p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达增加,但总GSK-3β蛋白和mRNA表达无变化。以LY294002处理后,高糖组RTECs Snail1、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达水平较未处理高糖组明显下降,但LY294002不影响总Akt1和GSK-3β蛋白表达。结论：Akt/GSK-3β可能介导了高糖诱导的RTECs锌指转录因子Snail1的表达上调。     

乳腺癌化疗耐药与MTDH过表达的关系及机制分析

目的探讨MTDH基因过表达对乳腺癌化疗耐药的影响及其机制。方法采用免疫组化SP法检测89例乳腺癌及癌旁组织中MTDH的表达及P-gp在乳腺癌组织中的表达。通过慢病毒感染使MCF-7乳腺癌细胞系过表达MTDH,采用CCK-8法检测MTDH过表达对乳腺癌细胞化疗耐药的影响。采用Western blot法检测MTDH过表达对乳腺癌细胞P-gp、β-catenin表达及AKT和GSK-3β磷酸化的影响。结果 MTDH在癌旁组织和乳腺癌组织中的高表达率分别为25.8%(23/89)和97.8%(87/89),MTDH在乳腺癌中的表达明显高于癌旁组织(P0.01);P-gp在乳腺癌组织中的高表达率为68.5%(61/89),乳腺癌中MTDH与P-gp表达呈显著正相关(r_s=0.568,P0.01)。在MCF-7乳腺癌细胞系中过表达MTDH,明显提高了MCF-7细胞对紫杉醇和阿霉素的耐受性,增加了P-gp和β-catenin蛋白表达水平,并且升高了p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平(P0.05)。结论 MTDH过表达与乳腺癌的化疗耐药密切相关,MTDH过表达引起的P-gp过表达和Wnt/β-catenin信号通路活化,可能与乳腺癌化疗耐药有关。     

HOXB7基因沉默对人胃癌细胞活力、迁移和侵袭的影响

目的:探讨靶向沉默HOXB7基因对人胃癌SGC-7901细胞活力、迁移和侵袭作用的影响及潜在机制。方法:设计靶向HOXB7的siRNA,然后瞬时转染胃癌SGC-7901细胞,实时荧光定量PCR和Western blot法检测siRNA靶向沉默的效果。MTT法检测细胞的活力,Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1蛋白的表达水平,Transwell小室侵袭实验检测SGC-7901细胞的侵袭能力,实时荧光定量PCR和Western blot法检测胃癌SGC-7901细胞PTEN和VEGF的表达水平以及p-AKT的蛋白水平。结果:胃癌组织中HOXB7基因在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组织。siRNA可有效靶向沉默SGC-7901细胞中HOXB7的表达,且沉默HOXB7表达后SGC-7901细胞活力明显下降,同时细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1的表达亦下调。靶向沉默HOXB7可明显抑制SGC-7901细胞中AKT的磷酸化水平,抑制胃癌细胞的侵袭转移,同时下调VEGF的表达水平,抑制胃癌组织中的肿瘤血管生成。结论:HOXB7作为一个癌基因,可上调细胞周期相关蛋白CDK4、cyclin D1和侵袭相关分子VEGF的表达,上调AKT的磷酸化水平,进而抑制PTEN的功能,促进胃癌细胞SGC-7901的生长、迁移和侵袭能力。     

特殊富含AT 序列结合蛋白1 在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖的影响

目的:研究特殊富含AT序列结合蛋白1(SATB1)在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖的影响。方法:免疫组化法检测30例胃癌组织、淋巴结组织及癌旁组织中SATB1的表达; RT-PCR及Western blot检测胃癌细胞株MGC-803和正常胃黏膜永生化细胞GES-1中SATB1的mRNA和蛋白的含量;电转染技术将真核表达质粒pc DNA3. 1-His-SATB1(HisSATB1)、载体质粒pc DNA3. 1(His-N)、沉默质粒p PLK+Puro-SATB1 shRNA(sh-SATB1)、沉默载体质粒p PLK+Puro(sh-N)转染入MGC-803细胞,24 h后Western blot检测各组细胞中SATB1、AKT、p-AKT的表达; CCK8检测细胞增殖活性。结果:SATB1在胃癌组织、转移淋巴结组织及MGC-803细胞中的表达水平显著升高(P0. 05)。sh-SATB1组MGC-803细胞中SATB1的蛋白表达显著降低,细胞增殖活性、AKT、p-AKT蛋白表达均显著降低(P0. 05); His-SATB1组MGC-803细胞中SATB1蛋白表达水平显著升高,细胞增殖活性增强,AKT、p-AKT蛋白表达均显著升高(P0. 05)。结论:SATB1在胃癌组织及细胞中高表达,SATB1可促进胃癌细胞的增殖,该效应可能是通过调控AKT合成及激活PI3K/AKT信号通路实现的。     

miR-125a-5p通过GSK-3β/Snail信号通路抑制乳腺癌细胞的上皮-间充质转化

目的:探讨微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)通过GSK-3β/Snail信号通路对乳腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:RT-qPCR检测人正常乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞中miR-125a-5p的表达量,同时检测miR-125a-5p质粒在人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的转染效率;趋化运动实验与Transwell侵袭实验检测趋化运动能力和侵袭能力;Western blot检测EMT相关标志物的变化,同时检测磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK-3β)的蛋白水平及Snail的转核情况。结果:乳腺癌细胞中miR-125a-5p的表达量明显低于人正常乳腺上皮细胞(P0.05);miR-125a-5p在转染miR-125a-5p质粒的MDA-MB-231细胞中表达水平明显增高;MDA-MB-231细胞的趋化运动能力在表皮生长因子(EGF)浓度为10μg/L时最强;在EGF刺激下,与MDA-MB-231/NC细胞组相比,MDAMB-231/miR-125a-5p细胞组的侵袭能力明显降低,上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)表达量升高,波形蛋白(vimentin)和p-GSK-3β的蛋白水平明显降低,同时Snail转核受到明显抑制;与MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con细胞组相比,MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2细胞组的侵袭能力明显增强,E-cadherin表达量降低,vimentin和p-GSK-3β的蛋白水平明显升高,同时促进Snail转核。结论:miR-125a-5p可通过GSK-3β/Snail信号通路抑制乳腺癌细胞的EMT,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

PI3K/Akt途径在Aβ诱导细胞凋亡过程中的作用

目的：探讨凝聚态β-淀粉样蛋白25-35片段（Aβ25-35）诱导细胞凋亡过程中PI3K/Akt转导通路的作用。方法: MTT法检测Aβ25-35作用不同时间后PC12细胞活力的变化;Annexin V-PI双染检测Aβ25-35作用不同时间后PC12细胞的凋亡情况;Western blotting检测Aβ25-35作用不同时间后p-AktSer473、p-GSK-3βSer9的水平变化。结果: 20μmol/L Aβ25-35作用不同时间（30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）后,MTT结果显示细胞活力均明显下降（P<0.05）;Annexin V-PI结果显示,Aβ25-35作用后均可引起细胞凋亡（P<0.05）;Western blotting结果表明,Aβ25-35作用于细胞后,p-AktSer473和p-GSK-3βSer9的表达均出现迅速的下调（P<0.05）,在作用3 h时两者的表达出现迅速的上升,在作用6 h时又出现表达的下调,两者在该时间段的变化趋势相符。p-AktSer473在Aβ25-35作用于细胞12 h后出现逐渐回升趋势,但在48 h时仍没有达到正常水平;而p-GSK-3βSer9的表达在Aβ25-35作用于细胞12 h后出现迅速的升高（P<0.05）,而后逐渐恢复到正常水平。结论: PI3K/Akt信号通路可能参与了Aβ诱导的细胞损伤,本研究为AD的发病机制及选择合适的药物作用时点提供了新思路。     

RNAi介导的IGF1R基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响

 目的: 研究RNA干扰(RNAi)介导的胰岛素样生长因子1受体 (IGF1R) 基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响。方法: 设计并筛选抑制IGF1R mRNA表达效率最高的siRNA序列,构建该序列的慢病毒表达载体,转染293T细胞进行病毒包装。将包装好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌细胞,筛选沉默 IGF1R 基因表达的稳定细胞株。将上述稳定细胞株扩大培养,检测细胞IGF1R mRNA表达变化,细胞生长、迁移与侵袭能力变化,以及Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21、BCL-XL的蛋白表达水平变化。结果: 与空白及阴性对照组比较,感染携带 IGF1R 干扰序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌细胞IGF1R mRNA表达水平显著下调,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡显著增加,细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制,细胞中IGF1R、Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL蛋白表达水平均显著降低。结论: RNAi介导的 IGF1R 基因沉默可明显抑制Huh7和Hep3B肝癌细胞生长及恶性生物学特征,这可能与IGF1R表达水平显著下调而引起上述调控细胞增殖、抗凋亡基因以及相关信号通路基因的蛋白表达水平显著降低有关。     

G蛋白偶联受体37(GPR37)上调促进人胶质瘤U251细胞的增殖

目的探讨G蛋白偶联受体37(GPR37)表达上调对人胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法构建携带GPR37基因的重组质粒,采用脂质体转染法在U251细胞上调表达GPR37,采用实时荧光定量PCR检测GPR37 mRNA水平,Western blot法检测GPR37、磷酸化的蛋白激酶B[p-AKT(Ser473)]蛋白水平,CCK-8法检测U251细胞增殖情况,流式细胞术检测U251细胞的细胞周期。结果与阴性对照组相比,过表达GPR37组细胞的GPR37 mRNA和蛋白水平显著提高。上调细胞的GPR37水平后,明显增加U251细胞的增殖、G1/G0期细胞比例降低,S期和G2期细胞比例升高,并增加p-AKT(Ser473)蛋白水平。结论上调U251细胞的GPR37水平可加速U251细胞周期进程、活化AKT途径并促进细胞增殖。     

沉默NANOG表达对人肝癌细胞HepG2中cyclin D1表达及细胞增殖的影响

 目的:探讨RNA干扰沉默NANOG表达后对肝癌细胞HepG2中细胞周期素D1(cyclin D1)表达及细胞增殖的影响。方法:将以NANOG基因为靶点的NANOG-siRNA瞬时转染肝癌细胞HepG2,real-time PCR和Western boltting检测NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期情况。结果:与mock组比较,转染NANOG-siRNA后,肝癌细胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下调(P＜0.05),细胞增殖能力下降(P＜0.05),进入G 0/G 1期的细胞比例增多(P＜0.05)。结论:沉默NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中cyclin D1的表达下降,导致细胞增殖能力下降。     

Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道重塑的机制研究

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道平滑肌细胞(ASMC)的功能和参与哮喘气道重塑的机制。方法:建立大鼠哮喘模型,提取大鼠ASMC。Western blot法检测哮喘组和正常组大鼠ASMC中β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、原癌基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白表达。抑制哮喘组和对照组ASMC中β-catenin和转录辅助因子p300/CBP间的相互作用后,采用CCK-8法和流式细胞术检测ASMC的细胞活力和周期变化。抑制P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性后,采用Western blot法检测c-Myc和cyclin D1的蛋白表达变化。结果:Western blot法显示哮喘组ASMC中β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平均明显高于对照组(P0.05),同时GSK-3β的蛋白表达水平则低于对照组(P0.05)。抑制β-catenin和p300/CBP间相互作用后,哮喘组ASMC的细胞活力下降幅度和细胞周期改变程度均较对照组更为明显(P0.05)。抑制P38 MAPK活性后,哮喘模型大鼠及对照大鼠ASMC中Wnt/β-catenin信号通路的靶蛋白c-Myc和cyclin D1的表达均下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路可能通过上调c-Myc和cyclin D1的表达、与P38 MAPK信号通路相互作用以及调控ASMC的生长和分化等途径,影响ASMC的功能,参与哮喘气道重塑。     

肥胖对PCOS患者卵巢颗粒细胞中GSK-3β表达的影响

目的研究肥胖与非肥胖PCOS患者卵巢颗粒细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)对糖代谢调控的影响。方法在行IVF/ICSI-ET助孕治疗的患者中,选取10例PCOS患者,根据体质量指数(BMI)分为肥胖组(BMI≥28,n=5)和非肥胖组(18.5BMI≤23.9,n=5);同期选择月经周期正常的育龄期妇女(18.5BMI≤23.9,n=5)。取卵日留取并体外培养卵巢颗粒细胞,采用2-脱氧葡萄糖荧光类似物(2-NBDG)检测颗粒细胞葡萄糖摄取能力,己糖激酶(HK)法检测颗粒细胞培养液内葡萄糖(G)、电化学发光法检测颗粒细胞培养液中睾酮(T),激酶活性比色法检测卵巢颗粒细胞内GSK-3β激酶活性,Western Blot法检测丝氨酸9位点发生磷酸化的GSK-3β(p-GSK-3β(Ser9))表达。结果与正常对照组相比,PCOS肥胖组和非肥胖组第48小时细胞培养液内G、T含量均增高(P0.05);颗粒细胞葡萄糖摄取能力下降(P0.001);GSK-3β酶活性上升(P0.05);p GSK-3β(Ser9)的表达下降(P0.05)。与PCOS非肥胖组相比,PCOS肥胖组第48小时细胞培养液内G、T含量升高(P0.05);颗粒细胞葡萄糖摄取能力降低(P0.001);GSK-3β酶活性上升(P0.05);p-GSK-3β(Ser9)的表达量下降(P0.05)。结论肥胖影响多囊卵巢综合征患者已经存在的内分泌与糖代谢紊乱。丝氨酸9位点发生磷酸化的GSK-3β可能在肥胖型多囊卵巢综合征的糖代谢异常中发挥重要作用。     

Integrin β1对胃癌细胞SGC7901多药耐药性的影响

目的:探究整合素β1(integrinβ1)对胃癌多药耐药性的影响及可能的作用机制。方法:Western blot法及q PCR实验检测胃癌细胞株SGC-7901及胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP中integrinβ1的表达情况。采用integrinβ1反义寡核苷酸转染,敲减胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP中integrinβ1的表达,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测integrinβ1、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-3/caspase-3、细胞色素C(CytC)和p-AKT/AKT的蛋白水平。结果:耐药细胞株SGC7901/DDP中integrinβ1的mRNA及蛋白表达水平均明显高于亲本细胞株;并且在亲本细胞株SGC7901中加入顺铂、长春新碱及5-氟尿嘧啶等化疗药物刺激后,integrinβ1的蛋白表达水平明显升高。敲减integrinβ1的表达可诱导胃癌耐药细胞SGC7901/DDP的凋亡,增加细胞对化疗药物的敏感性;此外下调Bcl-2/Bax、p-AKT~(Ser473)和p-AKT~(Thr308)的蛋白水平,同时促进线粒体Cyt-C的释放,上调cleaved caspase-3的蛋白水平。结论:敲减胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP的integrinβ1表达可恢复细胞对化疗药物的敏感性,促进细胞经线粒体路径的凋亡,其机制可能与抑制AKT的磷酸化,阻断该信号通路有关。