缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的 观察缺氧及应用小干扰RNA (siRNA)沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响.方法 构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP-RUNX3,CoC12化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响.结果 缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为(9.13±1.55),P＜0.05],siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90％),并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平.     

不同氧浓度下结肠癌细胞缺氧诱导因子-1α表达及糖酵解的差异

目的观察不同氧浓度下结肠癌细胞株SW480中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor HIF)-1α、糖酵解限速酶表达的差异及细胞培养上清液中乳酸浓度的变化。方法将传代培养的结肠癌细胞置于不同氧浓度的环境中培养12小时,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和western-blot法检测HIF-1αmRNA和蛋白表达水平;RT-PCR和western-blot法检测常氧和缺氧状态下结肠癌细胞糖酵解限速酶葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1,GLUT-1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A)基因的表达。比色法测定结肠癌细胞上清液中的乳酸浓度。结果随着培养环境氧浓度下降,结肠癌细胞中HIF-1α表达逐步增加(P0.05),糖酵解限速酶GLUT-1和LDH-A表达逐步增加(P0.05),结肠癌细胞培养上清液中乳酸浓度逐步增高(P0.05)。结论低氧环境可以上调结肠癌细胞中HIF-1α和GLUT-1、LDH-A的表达,以及细胞培养上清液中乳酸浓度。随着氧浓度下降,差异有统计学意义(P0.05)。低氧环境下HIF-1α上调可促进结肠癌细胞的增殖。     

小分子RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α加重缺氧状态肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死

目的 探讨沉默缺氧诱导因子1α （HIF-1α）对缺氧状态肾小管上皮细胞增殖、凋亡和坏死的影响。 方法 利用氯化钴模拟缺氧状态,并应用小分子RNA干扰（siRNA）技术沉默HIF-1α基因表达。将细胞分成5组,分别是正常培养组、缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组。用MTT试验检测细胞的生长抑制率;用TUNEL法、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（aspase）-3蛋白定量法检测细胞的凋亡率;检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活力来测定细胞的坏死情况;用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞HIF-1α、HIF-2α、葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）、血管内皮生长因子（VEGF） mRNA和蛋白表达水平。 结果 （1）siRNA的细胞转染效率为95%～100%。在常氧条件下,终浓度100 nmol/L 的HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率为70%;在缺氧条件下,HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率达到97%。（2）HIF-1α siRNA组细胞的生长抑制率显著高于其它组（P < 0.05）;细胞凋亡率在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）;HIF-1α siRNA组细胞培养液中LDH水平显著高于缺氧培养组、转染试剂组和阴性对照组（P < 0.05）。（3）HIF-1α siRNA组细胞的HIF-1α、Glut-1、VEGF mRNA和蛋白表达量显著低于缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组（P < 0.05）;而HIF-2α mRNA和蛋白表达在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下肾小管上皮细胞Glut-1和VEGF表达,加重缺氧状态下肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死。     

缺氧诱导因子1α对缺氧条件下大鼠心肌细胞糖酵解的影响

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对缺氧状态下大鼠心肌细胞糖酵解的影响。方法常规分离、培养大鼠心肌细胞,分为单纯缺氧组:使用无糖培养基在低氧混合气体(体积分数94%N2、5%CO2、1%O2)中培养;HIF-1α抑制组:先利用RNA干扰技术构建HIF-1α蛋白低表达的细胞模型,再作上述缺氧培养。两组细胞均设缺氧前(常规培养)及缺氧1、3、6、12、24h6个时相点,采用生物化学方法检测细胞中糖酵解关键酶己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性以及培养上清液中乳酸(LA)的含量。结果(1)HK、PFK活性:与缺氧前比较,两组心肌细胞两酶活性均呈先升高后下降的变化趋势。单纯缺氧组两酶活性峰值分别为(159±13)、(298±44)U/g.HIF-1α抑制组两酶活性在缺氧1、3、6h时均明显低于单纯缺氧组(P<0.05或0.01),其峰值分别为(133±55)、(188±55)U/g.(2)LDH活性、LA含量:与缺氧前(92±12)U/g比较,单纯缺氧组细胞LDH活性缺氧后显著升高,6h时达高峰(2568±125)U/g(P<0.01),随后逐渐下降;各时相点培养上清液中LA含量也成倍增加。HIF-1α抑制组细胞的LDH活性于缺氧3h时达峰值(2125±126)U/g,明显高于缺氧前(P<0.01);培养上清液中LA含量亦较缺氧前增高(P<0.01),但增幅较小。结论缺氧条件下大鼠心肌细胞中HIF-1α高表达是细胞糖酵解持续增强的直接原因,此为心肌细胞应对缺氧环境的重要内源性保护机制。     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响

目的： 观察反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响。方法：实验分组：（1）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为缺氧对照组；（2）常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3 细胞设为常氧对照组；（3）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为实验组。采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测各组的HIF-1α和survivin表达情况。 流式细胞术和MTT比色法检测不同剂量的化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他宾)对各组的凋亡率和生长抑制率的影响。 结果：实验组HIF-1α和survivin的表达明显降低 (P<0.05)，与对照组相比，实验组的凋亡率、抑制率与剂量成正比，高剂量引起高抑制(P<0.05)。 结论：反义HIF-1α可能通过阻断survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。据此可望通过阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供一种新途径。     

缺氧应激对HepG2细胞中甲硫氨酸腺苷转移酶2A基因表达的影响

目的 观察体外缺氧条件下肝癌细胞株HepG2中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对MAT2A基因表达的调控作用.方法 构建人MAT2A启动子真核表达载体质粒,CoCl2化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧条件下MAT2A启动子活性,HIF-1α和MAT2A在HepG细胞中的共定位、mRNA和蛋白水平的表达.以及小干扰RNA(siRNA)沉默HIF-1α后对MAT2A基因表达的影响.结果　缺氧24 h能使HepG2细胞活性增加到高峰(41.26±2.34),同时MAT2A基因的表达也较常氧时显著升高(P＜0.01),siRNA转染HepG2细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90%),并导致MAT2A基因的表达也受到明显抑制.结论　缺氧促使HepG2细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调MAT2A基因的表达水平.

Abstract：

Objective To observe the expression of hypoixa inducible factor-1α (HIF-α) and methionine adenosyltransferase-2A (MAT2A) gene in HepG2 cells under hypoxia in vitro, and explore the regulation of MAT2A gene expression by HIF-1α. Methods Human MAT2A promoter eukaryotic expression vector was constructed. CoCl2 was used as a chemical hypoxia-inducible reagent to mimic tumor bypoxic microenvironment. MAT2A promoter activity, and mRNA and protein expression of HIF-α were detected in the HepG2 cells transfected with RNA interference (RNAi) originated by small interfering RNA (siRNA). The change of MAT2A gene expression was observed after HIF-1α gene silencing. Results Under hypoxia for 24 h, HepG2 cell activity was increased to (41.26 ± 2. 34 ), and the mRNA and protein expression levels of MAT2A were up-regulated (P ＜0. 01 ). After siRNA targeting, the HIF-1α was downregulated efficiently in HepG2 cells (inhibition ratio: 90% ), and MAT2A gene was down-regulated as well. Conclusion Hypoxia can increase protein level of HIF-1α in HepG2 cells, and HIF-1α up-regulates the gene expression of MAT2A.     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对人膀胱尿路上皮癌T24细胞增殖和凋亡的影响

目的 探究RNA干扰靶向沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在人膀胱尿路上皮癌(BUC) T24细胞株中的表达对T24细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建4个针对HIF-1α的小干扰RNA(siRNA)表达质粒PGC-siHIF-1α1-4,脂质体法稳定转染T24细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染细胞HIF-1α rnRNA和基因表达,噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡情况.结果 4个HIF-1α mRNA表达质粒均能不同程度的抑制转染细胞的HIF-1α膜mRNA和基因表达.其中以PGC-siHIF-1 α3的作用最大,效果最佳,该组G0/G1期阻滞率(61.8±1.5)％,细胞增殖受抑率41.7％,细胞凋亡率19.3％,与对照组有统计学差异(P＜0.01).结论 HIF-1α siRNA表达质粒可抑制膀胱癌细胞生长并促进其凋亡,有望成为提高膀胱癌分子靶向治疗的新位点.     

缺氧诱导基因-1α和gax基因共转染对移植静脉内膜重塑态的效应与分子机制

目的 探讨缺氧诱导基因(HIF-1α)和同源盒基因(gax)过表达对移植静脉内膜过度增生的影响及其机制.方法 自体静脉移植术大鼠28只均分为基因转染组和非基因转染组.于核酸、蛋白、细胞超微结构及细胞形态层次分析移植静脉中HIF-1α和gax基因表达与血管平滑肌细胞(VSMC)表型、中膜厚度等指标.结果 基因转染组与非基因转染组比较:HIF-1α和gax的mRNA及其蛋白表达增强(P＜0.05);增殖型VSMC和增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞减少(P＜0.05);TUNEL阳性细胞增多(P＜0.05);内皮修复较显著,较多肌-内皮连接结构形成;内膜过度增生程度有所减弱.结论 HIF-1α和gax基因联合转染对移植静脉内膜过度增生具有一定的抑制作用.     

缺氧诱导因子-1α对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响

目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对低氧状态下前列腺癌PC-3细胞株增殖及侵袭的影响。 方法 利用转染试剂Fermentas将人HIF-1α重组表达质粒pcDNA3.1-HIF-1α转染PC-3细胞株后,低氧环境培养,采用G418筛选,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞株,分别命名为pcD-NA3.1-HIF-1 α-PC-3、pcDNA3.1-PC-3及PC-3组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测3组细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达情况;噻唑盐法测定细胞生长;transwell小室检测侵袭能力。 结果 与pcDNA3.1-PC-3组和PC-3组相比,pcDNA3.1-HIF-1 α-PC-3组细胞内HIF-1α mRNA条带增强不明显,pcDNA3.1-HIF-1α-PC-3组细胞内HIF-1α蛋白的条带明显增强,HIF-1α过表达的PC-3细胞增殖速度明显增快,侵袭细胞数明显增多。 结论 HIF-1α过表达对PC-3细胞株的增殖及侵袭具有促进作用。     

缺氧诱导因子-1α对体外模拟CO2气腹下人胃癌细胞凋亡的影响

目的 通过体外模拟CO2气腹环境,构建沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的RNAi表达载体,探讨HIF-1α对CO2气腹环境下人胃癌细胞MKN-45凋亡的影响及机制.方法 利用密闭培养箱模拟CO2气腹,气腹机维持培养箱内压力分别为0、5、10、15 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),采用RT-PCR方法和Western blot方法观察沉默HIF-1α前后MKN-45细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达变化.免疫组化技术观察沉默HIF-1α前后细胞bcl-2/bax表达变化.Annexin V-FITC/PI舣标染色、流式细胞仪检测沉默HIF-1α前后细胞凋亡比例变化.结果 沉默HIF-1α前15 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达(1.48±0.22和1.34±0.09)以及10 nnn Hg组细胞蛋门表达(1.25±0.10)均显著高于对照组(0.55±0.17和0.83±0.04)(P＜0.05).0、5、10 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA和0、5 mm Hg蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).沉默HIF-1α前15 mm Hg组细胞bcl-2/bax比值(0.78±0.05)较对照组(1.43±0.15)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡比例(11.70±0.12)较对照组(0.22±0.07)显著增加(P＜0.01).而在沉默HIF-1α后15 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA表达(0.52±0.11)和蛋白表达(0.92±0.02)、bcl-2/bax比值(1.57±0.04)、细胞凋亡比例(0.45±0.11)与对照组比较均无显著差异(P＞0.05).结论 在CO2气腹环境压力为0、5、10 mmHg CO2时MKN-45细胞凋亡比例与对照组比较无显著差异,压力为15 mm Hg时CO2气腹可促进胃癌细胞凋亡,HIF-1α可能为促进细胞凋亡的重要因子.     

HIF-1α基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞VEGF和MMP-2基因表达的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因沉默对人肝癌SMMC-7721细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法构建HIF-1α基因的RNA干扰(RNAi)表达载体(HIF-1α-shRNA-pGenesil-1)和阴性对照载体(shRNA-HK-pGenesil-1),并将其与质粒结合。将人肝癌SMMC-7721细胞分为沉默组、阴性对照组和空白对照组,分别转染HIF-1α-shRNA-pGenesil-1重组载体、shRNA-HK-pGenesil-1重组载体和空载体pGenesil-1。转染细胞经浓度为500μg/mL的G418溶液筛选后获得带有转染重组载体的细胞克隆,分别于常氧、低氧6 h、低氧12 h及低氧24 h条件下培养,再采用实时定量逆转录聚合链式反应(RT-PCR)检测细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达。结果常氧条件下,沉默组、阴性对照组和空白对照组细胞中均无HIF-1α mRNA的表达,且3组细胞中VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平比较差异均无统计学意义(P0.05)。低氧培养6、12及24 h时,沉默组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均低于同时点空白对照组和阴性对照组(P0.05),但同时点空白对照组和阴性对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。与常氧条件对应组别比较,沉默组、阴性对照组和空白对照组各低氧条件组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均较高(P0.05);低氧条件下,3组细胞中HIF-1α mRNA、VEGF mRNA及MMP-2 mRNA的表达水平均呈下降趋势,同组内3个时点间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论利用RNAi技术有效沉默人肝癌SMMC-7721细胞中HIF-1α基因的表达后,VEGF mRNA和MMP-2 mRNA的表达水平均降低,提示沉默HIF-1α基因可抑制原发性肝癌的浸润和转移。     

siRNA沉默HIF-1α基因对前列腺癌PC-3细胞多西紫杉醇化疗敏感性的影响

目的:探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对前列腺癌PC-3细胞多西紫杉醇(docetaxel,DTX)化疗敏感性的影响。方法:实验分为PC-3组,PC-3+NCsiRNA组,PC-3+HIF-lαsiRNA组。用脂质体Lipofectamine2000将经过筛选证实有效的HIF-1αsiRNA序列和阴性NC siRNA序列转染PC-3细胞。待细胞转染或不转染后继续培养,根据实验要求时间点加入DTX。采用CCK-8法检测转染后96 h内各组细胞的生长增殖情况,流式细胞仪检测加DTX后48 h各组细胞的周期分布、凋亡率及多药耐药基因P糖蛋白(MDR/P-gp)的表达。结果:PC-3+HIF-1αsiRNA组肿瘤抑制率高于PC-3+NC siRNA组,尤以转染后48 h表现的较为明显;转染后48 h,PC-3+HIF-1αsiRNA组细胞存活率均明显低于PC-3组和PC-3+NCsiRNA组(P均0.01)。细胞周期分布变化,PC-3+HIF-1αsiRNA组较两对照组比较,G0/G1期细胞百分数较低,而G2/M期细胞百分数稍高(P均0.01)。细胞凋亡结果,PC-3+HIF-1αsiRNA组细胞凋亡率明显高于两对照组(P均0.01)。各组细胞MDR/P-gp表达无明显差异(P均0.05)。结论:沉默HIF-1α基因能增强DTX对前列腺癌PC-3细胞的生长抑制,通过调整细胞周期重新分布、诱导细胞凋亡,增加前列腺癌PC-3细胞对化疗的敏感性,而这一作用与MDR/P-gp无明显相关。     

siRNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对胰腺癌细胞TLR4表达的影响

目的 观察体外乏氧培养条件下胰腺癌细胞系Panc-1中HIF-1α和TLR4的表达,探讨HIF-1α在低氧条件下对胰腺癌细胞TLR4的调控作用.方法 低氧箱培养和CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境,RT-PCR、免疫荧光法和流式细胞法分别检测缺氧状态下HIF-1α和TLR4在mRNA和蛋白水平的表达.采用化学合成小干扰RNA( siRNA)介导的RNA干扰技术(RNAi)用siRNA转染Panc-1细胞.观察转染后HIF-1α沉默效果.结果 低氧条件下,Panc-1细胞HIF-1αmRNA水平稳定,蛋白表达显著升高,而TLR4 mRNA和蛋白的表达均显著升高.siRNA转染Panc-1后能够显著下调HIF-1α的基因表达,同时TLR4基因的表达上调也受到明显抑制.结论 缺氧促使胰腺癌Panc-1细胞TLR4在蛋白水平表达升高,TLR4信号通路可能和HIF-1α信号通路存在相互联系,并且共同促进了胰腺癌的恶性进展.     

Angiostatin基因联合反义HIF-1α基因治疗人肝癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的研究Angiostatin基因联合反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因治疗人肝癌裸鼠皮下移植瘤的协同抑制作用。方法用人肝癌细胞株SMMC-7721建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。四组荷瘤裸鼠分别注射质粒PcDNA3、Angiostatin/PcDNA3、HIF-1α/PcDNA3B、Angiostatin/ PcDNA3 HIF-1α/PcDNA3B。观察肿瘤生长曲线,检测肿瘤的Angiostatin、血管内皮生长因子(VEGF)、HIF-1α表达和微血管密度(MVD),利用TUNEL染色法行原位细胞凋亡分析。结果Angiostatin基因治疗在早期具有抑制肿瘤生长的作用;Angiostatin基因治疗组的MVD(24.8±2.8)低于空质粒对照组(30.2±4.1),VEGF表达高于空质粒对照组,细胞凋亡指数(2.87±0.48)高于空质粒对照组(1.55±0.43);联合治疗组有明显抑制肿瘤生长的作用,HIF-1α局部低表达,MVD (14.6±2.1)低于Angiostatin基因治疗组(24.8±2.8),VEGF表达低于单独治疗组,细胞凋亡指数(5.12±0.63)高于单独治疗组。结论肿瘤对Angiostatin基因治疗可以产生耐受性;反义HIF-1α基因阻断肿瘤的缺氧适应途径在一定程度上解决了抗血管生成治疗的耐药性问题。     

缺氧下调结肠癌细胞株CDX2表达的研究

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和基因系尾型同源盒基因2(CDX2)在人结肠癌细胞株SW480和LS174T不同缺氧时间的表达及其可能的作用机制。方法(1)MTT方法检测在不同CoCl2浓度(100,150,200μmol/L)下和不同时点(24,36,48 h)时对SW480和LS174T细胞活力以及增殖的影响,筛选适宜的CoCl2作用浓度。(2)在细胞化学缺氧培养相应时段,采用半定量RT-PCR技术检测HIF-1α,Snail和CDX2的mRNA的表达变化;同时采用Western blotting技术检测CDX2的蛋白表达。结果结肠癌细胞株在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力明显受到抑制。在低浓度CoCl2(100μmol/L)干预下,随着缺氧时间的延长,HIF-1α和Snail mRNA表达逐渐上升,缺氧24 h时达到高峰,CDX2 mRNA及蛋白表达水平逐渐下降。结论缺氧诱导HIF-1α过表达可通过下调CDX2而加速结直肠癌的进展。     

缺氧诱导对人结肠癌SW480细胞缺氧诱导因子-1α和Survivin基因表达的影响

目的 构建缺氧诱导模型和观察缺氧对人结肠癌SW480细胞系缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和Survivin基因表达的影响。方法 利用氯化钴（CoCl2）构建缺氧诱导模型；利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分别测定CoCl2缺氧诱导与SW480细胞HIF—1α和Survivin基因mRNA表达的时效关系（0、2、4、8、24h）和量效关系（0、50、100、150、200／μmol／L）。结果HIF-1α和Survivin基因mRNA表达与氯化钴浓度呈明显的剂量依赖关系；HIF-1α基因表达随诱导时间的延长而逐渐增强，4h亚组出现一个表达高峰，Survivin基因在缺氧诱导4h呈现表达最高峰；HIF-1α与survivin基因mRNA的表达在缺氧诱导量效关系（r=0．521，P＜0．05）和时效关系（r=0．693，P＜0．05）中均呈显著正相关。结论 缺氧可以诱导HIF—1α和Survivin基因的表达增加；HIF—1α与Survivin基因的表达均呈显著相关，提示Survivin基因可能与HIF—1α存在某种调控关系并在缺氧抗凋亡机制中发挥作用。     

RNA干扰抑制缺氧诱导因子1α表达对缺氧内皮细胞通透性的影响

目的 了解RNA干扰技术特异性抑制缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达对缺氧血管内皮细胞通透性的影响.方法 利用质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR构建针对人HIF-1α基因的RNA干扰表达载体.将VE细胞分为正常对照组、缺氧组(置于含体积分数1%O_2的混合气体环境中缺氧处理6 h)、转染组、转染缺氧组(转染载体后再进行缺氧处理).采用RT-PCR法检测正常对照组、转染组HIF-1αmRNA表达,采用蛋白质印迹法检测4组细胞HIF-1α蛋白表达.荧光分光光度计检测单层VE细胞的通透性.将上述缺氧处理替换为HIF-1α特异性诱导剂1 mmol/L二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG),分为DMOG组、转染DMOG组、正常对照组、转染组,采用蛋白质印迹法观察各组HIF-1α蛋白表达.除通透性检测数据用荧光强度值表示外,其他数据用密度比值表示.实验结果进行组间两两t检验.结果 正常对照组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.765±0.069,转染组细胞HIF-1α mRNA相对含量为0.093±0.007,组间比较,差异有统计学意义(t=16.696,P<0.05).转染缺氧组细胞HIF-1α蛋白含量为0.591±0.029,显著低于缺氧组(2.612±0.259,t=13.415,P<0.05);转染DMOG组HIF-1α蛋白含量为0.566±0.008,显著低于DMOG组(3.243±0.551,t=6.975,P<0.05).缺氧组单层血管内皮细胞通透性(41.6±11.1)较正常对照组(9.4±1.5)显著升高(t=6.238,P<0.05),转染缺氧组单层血管内皮细胞通透性(13.3±4.5)显著低于缺氧组(t=5.430,P<0.05).结论 采用特异性针对HIF-1α基因的RNA干扰技术,能有效抑制内皮细胞HIF-1α表达,并明显抑制缺氧引起的血管内皮细胞通透性增强.     

缺氧诱导因子1α对CO2气腹环境下人胃癌细胞凋亡的影响

目的 通过体外模拟CO2气腹环境,构建沉默缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的RNAi表达载体,探讨HIF-1α对CO2气腹环境下人胃癌细胞MKN-45凋亡的影响及机制.方法 利用密闭培养箱模拟CO2气腹,气腹机维持培养箱内压力分别为0、5、10、15mm Hg.采用荧光定量RT-PCR方法和Western blot方法观察沉默HIF-1α前后MKN-45细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达的变化;免疫细胞化学技术观察沉默HIF-1α前后细胞bcl-2/bax表达的变化;Annexin V-FITC/PI双标染色、流式细胞仪检测沉默HIF-1α前后细胞凋亡比例的变化.结果 沉默HIF-1α前15 mm Hg组细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达(分别为1.51±0.04、4.44±0.30)均显著高于对照组(0.584±0.06、2.01±0.06)(P<0.01).沉默HIF-1α前15mmHg组细胞bcl-2/bax比值(0.77±0.05)较对照组(1.43±0.02)明显降低(P<0.05),细胞凋亡比例(11.60±2.11)较对照组(0.30±0.02)增加.而在沉默HI-1α后15 mm Hg组细胞HIF-1α mRNA(0.464±0.04)和蛋白表达(0.92±0.02)、bcl-2/bax比值(1.61±0.04)、细胞凋亡比例(0.4±0.03)与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05).结论 在CO2气腹环境压力为0、5、10mm Hg CO2时MKN-45细胞凋亡比例与对照组比较无差异,压力为15mm Hg时CO2气腹可促进胃癌细胞凋亡.HIF-1α可能为促进细胞凋亡的原因之一.     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

胰岛素调节人胰腺癌细胞ASPC-1中HIF-1α的表达研究

目的 探讨胰岛素对胰腺癌细胞株ASPC-1中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响.方法 将ASPC-1细胞分为5组:常氧组,常氧加胰岛素组,缺氧组,同一缺氧时间不同胰岛素浓度组以及相同胰岛素浓度不同缺氧时间组,实时定量PCR检测HIF-1α基因表达,免疫细胞化学与Western blot检测HIF-1α蛋白表达水平的变化.Transwell实验检测加入胰岛素后肿瘤细胞侵袭能力的变化.结果 常氧下ASPC-1细胞即有一定水平HIF-1α表达,加入胰岛素刺激后HIF-1α蛋白表达随着胰岛素浓度的升高和作用时间的延长而逐渐升高,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);缺氧条件下HIF-1α表达较常氧时升高(P＜0.05);相同缺氧时间使用不同浓度胰岛素刺激时,高浓度胰岛素刺激下HIF-1α的表达较单纯缺氧更高(P＜0.05),低浓度胰岛素对HIF-1α无明显作用(P＞0.05);使用相同胰岛素处理后再进行缺氧处理,随着时间延长HIF-1α的表达先升高后下降,但各处理组较对照组差异均有统计学意义(P＜0.05).Transwell实验显示胰岛素可增强胰腺癌细胞的侵袭能力(P＜0.05).结论 胰岛素可上调胰腺癌细胞ASPC-1中HIF-1蛋白表达,并且这种作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性.胰岛素还可以增加ASPC-1的侵袭能力.

Abstract：

Objective To investigate the effect of insulin on the expression of hypoxia-inducible factor-1α in human pancreatic cancer cell line ASPC-1. Methods We divided ASPC-1 cells into five groups: normoxia; normoxia stimulated with insulin; hypoxia; hypoxia pretreated with different concentration of insulin; hypoxia of different time points pretreated with same concentration of insulin. Real-time PCR was used to test the expression of HIF-1α mRNA. Immunohistochemistry was used to examine the expression of HIF-1α in ASPC-1 of insulin treated cancer cells. Western blot was used to determine the expression of HIF-1 α protein in those cells. Transwell was used to test whether insulin could enhance the invasion ability of ASPC-1 pancreatic cancer cells. Results Insulin promotes HIF-1α protein expression. ASPC-1 cells expressed low levels of HIF-1α protein under normoxic condition. After stimulated with insulin, the expression of HIF-1 α protein significantly increased (P ＜ 0. 05 ). After treated with hypoxia, the expression of HIF-1α protein also increased(P ＜ 0. 05 ). Low concentrations of insulin didn't increase the expression of HIF-1α under hypoxic environment ( P ＞ 0. 05 ), while high concentration of insulin could increase its expression(P ＜ 0. 05). When ASPC-1 cells pretreated with insulin suffered from hypoxia, the expression of HIF-1α first increased then decreased moderately( P ＜0. 05). Insulin could enhance the invasion ability of pancreatic cancer cells( P ＜ 0. 05 ). Conclusions Insulin mediates the expression of HIF-1α protein in human pancreatic cancer ASPC-1 cells with the characteristics of dose and time dependency. Insulin could enhance the invasion ability of ASPC-1 cells.