抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

泡球蚴Em18多克隆抗血清的制备和鉴定

目的：制备和鉴定泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清.方法： 利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18-GST蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源抗Em18多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法鉴定其特异性.结果： （1）SDS-PAGE检测表明,rEm18-GST蛋白得到成功表达,在相对分子量为50 kDa处有表达条带.（2）纯化后获得高纯度的rEm18-GST蛋白.（3）ELISA结果表明,抗Em18抗血清的抗体滴度为1∶25 600;Western blot结果表明抗Em18抗血清能与rEm18-GST蛋白发生特异性结合.结论： 获得了特异性识别rEm18-GST蛋白的多克隆抗体,为进一步筛选Em18模拟抗原表位奠定基础.     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

噬菌体随机肽库筛选日本血吸虫22.6kDa蛋白有效抗原表位的初步研究

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选出中国大陆株日本血吸虫22.6kDa蛋白（Sj22.6kDa抗原表达的短肽分子，探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。方法：以纯化的抗日本血吸虫22.6kDa的多克隆抗体IgG为配基，对噬菌体12肽库进行5轮亲和筛选，富集特异性噬菌体，挑取克隆，经序列分析，免疫识别和动物初筛后获得阳性克隆。结果：经过5轮筛选，特异性噬菌体得到有效富集。随机挑选的24个噬菌体克隆中获得4个有效抗原表位。结论：利用噬菌体随机肽库筛选可获得类似日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导抗血肿虫的保护性免疫。     

O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体识别表位模拟肽的筛选鉴定

【摘　要】目的：以纯化的有高度特异性的IXiao3G6单抗为靶分子,对噬菌体随机7肽库进行淘筛,以期筛选到与O1群小川型霍乱弧菌单抗有高亲和力的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的研制奠定基础。方法：运用噬菌体随机7肽库技术,以纯化的IXiao3G6单抗为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库 3 轮筛选,以双抗夹心ELISA和竞争抑制实验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性,并进行阳性克隆序列测定和同源性分析。结果：3轮筛选后,阳性噬菌体得到有效富集,夹心ELISA检测随机挑取的25个噬菌体克隆,有22个噬菌体克隆为阳性,测序表明其中20个阳性克隆的氨基酸序列完全一致,均为APAIPAS。对该序列同源性分析,未发现有相同的已知序列。竞争抑制实验表明,O1群小川型霍乱弧菌脂多糖（lipopo-lysaccharide,LPS）能很好地抑制阳性克隆与IXiao3G6 McAb的结合,抑制程度随LPS浓度的升高而增加,而对照细菌的LPS则不具有相应的抑制作用,进一步提示噬菌体克隆展示肽模拟了O1群小川型霍乱弧菌LPS抗原表位。结论：筛选到模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS的抗原表位的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的开发与设计提供了实验依据。     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

基于抗原表位预测的MUC1模拟肽表位筛选

目的:预测粘蛋白1(Mucin1,MUC1)抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位.方法:对MUC1的二级结构及免疫原性进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的Ma695抗体筛选噬菌体随机12肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果:MUC1存在有17个潜在的抗原表位区域.经3轮筛选,获得了14个阳性克隆,DNA序列分析并推导出其氨基酸序列:KHYDPFHHRMPQ,QADTARS VALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIHYWNHNRV;4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论:预测MUC1抗原B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能奠定了基础.所得序列KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIH YWN HNRV能模拟MUC1抗原表位.     

日本血吸虫抗原的表位模拟肽筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雄虫抗原的表位模拟肽 ,并探讨其诱导小鼠抗日本血吸虫的免疫保护性。　方法　用日本血吸虫可溶性雄虫抗原的IgG对噬菌体随机 1 2肽库进行亲和筛选。 3轮筛选后 ,经Dot-ELISA检测获得阳性噬菌体克隆 ,并用混合特异性噬菌体克隆免疫小鼠及进行抗日本血吸虫免疫保护性分析。　结果　 1 8个特异性噬菌体克隆均显示有抗原性 ,其噬菌体混合克隆免疫诱导小鼠产生了特异性抗体 ,以及 31 72 %的减虫率和 51 54%的减卵率 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 0 0 1 )。　结论　筛选噬菌体肽库获得的日本血吸虫可溶性雄虫抗原的表位模拟肽分子能诱导小鼠产生抗日本血吸虫的保护性免疫。     

利用噬菌体随机肽库技术分析丙肝患者血清中抗HCV抗体的表位

目的：分析患者血清中抗HCV抗体的抗原表位。方法：用Protein A亲和层析柱从患者血清中纯化、制备抗HCV多克隆抗体；以此对噬菌体表面展示的随机6肽库进行亲和筛选。结果：经具有良好富集效果的三轮筛选好，从第三轮挑选出的12个克隆进行结合试验，发现8个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应；测序表明阳性克隆的外源肽具有一定的相似性。用阳性噬菌体克隆检测20例患者血清，有程度不等的阳性反应。结论：用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位。     

日本血吸虫成虫67kD抗原模拟表位的筛选及其免疫原性

目的：筛选日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，对其免疫学活性予以鉴定。方法：用粗提日本血吸虫成虫67kD抗原的抗体IgG作配体筛选噬菌体12肽库，随机挑取三轮筛选后的噬菌体克隆，Dot-ELISA检测其特异性：用混和阳性噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染后45d剖杀，计数虫荷。结果：经三轮筛选，特异噬菌体得到富集，挑取的11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定均与67kD抗原免疫血清呈阳性反应。混合噬菌体克隆的免疫血清可识别67kD抗原，并具有一定的抗血吸虫的免疫保护效果。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，这些表位具有良好的免疫原性。     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

Em18.3重组蛋白的表达及其免疫诊断特性的研究

目的：在大肠杆菌中表达和纯化截短的泡球蚴rEm18.3抗原重组蛋白,对其免疫诊断特性进行鉴定.方法： IPTG诱导pET41a-Em18.3原核表达质粒,表达和纯化rEm18.3-GST重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Western blot法对其进行初步鉴定,ELISA法确定其免疫诊断特性.结果： rEm18.3-GST重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE电泳显示相对分子量为45 kDa.Western blot结果表明,rEm18.3-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别.对56例多房棘球蚴病（AE）、88例细粒棘球蚴病（CE）、24例其他寄生虫病、24例其他疾病和24例健康者共236份血清进行ELISA检测结果显示,对AE血清诊断的敏感性为10.7%,特异性为99.4%,阳性预测值85.7%,阴性预测值78.1%.结论： rEm18.3-GST免疫诊断价值较低,Em18抗原重要的表位可能位于1-40位氨基酸.     

截短的泡球蚴Em18基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定

目的：构建截短的泡球蚴18（Em18）基因的原核表达质粒，获得高效表达、有生物活性的重组蛋白，并对其进行初步鉴定。方法：DNAman软件设计引物，PCR法扩增并构建截短的pET41a-Em18．1原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18．1-GST重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳及Western免疫印迹法对其进行初步鉴定。结果：成功构建出截短的pET41a-Em18．1，SDS-PAGE检测表明rEm18．1-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为41kDa处有表达条带。Western blot结果显示rEm18．1-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别。结论：截短的pET41a-Em18．1原核表达质粒表达的rEm18．1-GST重组蛋白具有良好的抗原性，为Em18抗原表位的分析奠定基础。     

MUC1抗原的表位预测及模拟位的筛选

目的预测MUC1抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟位.方法联合运用多种方法对MUC1的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等方面进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:1-10,24-54,65-77,84-91,108-134,140-156,159-174,179-196,199-210,220-233,237-265,270-299,316-337,351-362,369-396,411-420,445-502.经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP 4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论应用多参数预测MUC1抗原的B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能、选择表达新型MUC1分子奠定了基础.所得序列TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位.     

泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化方法的优化

目的：筛选和优化泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法,为进一步筛选Em18抗原表位奠定基础.方法：原核表达pET41a-Em18重组质粒,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达,获得rEm18-GST蛋白,采用不同的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别采用GST柱、His柱及两者结合方法,改变不同的平衡、洗涤和洗脱缓冲液浓度,纯化rEm18-GST蛋白.结果：（1） rEm18-GST蛋白在相对分子质量为50 kDa处有表达条带,蛋白表达量随诱导时间的延长而增加;（2）超声程序为工作1 s,间歇3 s,每个循环时程10 min,加入蛋白酶抑制剂,可降低目的蛋白的降解;（3）采用单纯His柱可获得回收量高、纯度高的rEm18-GST蛋白.结论：（1）对含有GST-tag和His-tag双重标签重组蛋白的纯化,应用His柱更有效,更经济;（2）建立和优化一套从大肠杆菌细胞中分离纯化重组Em18蛋白的有效方法.     

抗IgE中和抗体表位的筛选和鉴定

目的: 对噬菌体线性7肽库进行筛选,得到诱发机体产生抗IgE中和抗体的IgE表位肽. 方法: 以抗IgE抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA鉴定阳性克隆. 结果: ELISA鉴定随机挑选的经3轮筛选后所得48个噬菌体克隆,其中15个克隆显示与抗IgE抗体有较强的结合能力,序列测定得到氨基酸序列为:DHIDMGL;DHMWLGL;DHQDAGF;DHMDQNL. 竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IgE竞争性结合抗IgE mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽能与抗IgE抗体特异性结合. 结论:经筛选得到的7肽序列具有相似的骨架区,并与IgE的CH3区高度同源. 初步验证这些噬菌体展示肽能与抗IgE中和抗体特异性结合,为IgE相关多肽疫苗的研究提供了依据.     

应用噬菌体肽文库筛选肾综合征出血热病毒优势B细胞结合表位肽

目的:应用噬菌体展示肽文库筛选鉴定肾综合征出血热病毒优势B细胞结合表位肽。方法:以Prote in-A纯化的肾综合征出血热患者恢复期血清为筛选配基,对经正常人血清预吸附的噬菌体展示随机12肽文库(或次级肽文库)进行生物亲和淘选;夹心ELISA、竞争ELISA鉴定所获得克隆的结合特性,并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:ELISA测定显示,通过5轮淘选得到的噬菌体克隆半数以上可与筛选血清发生特异性结合;对45个阳性克隆进行序列测定分析,根据其推导的氨基酸序列可大致分为8组,同源性分析显示,Ⅰ~Ⅶ组序列基序可能为LVXKR、LTXR、IXKP、LXPA、VGA、KX IR、EKXP,其中4组基序在病毒结构蛋白氨基酸序列中发现同源区。结论:获得了一组肾综合征出血热病毒(HFRSV)优势B细胞表位肽,HFRSV核蛋白可能是诱导高水平抗体的主要免疫原,研究结果为基于表位的基因工程诊断试剂的研制和多肽疫苗的设计提供依据。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。