PKH26荧光示踪剂在神经干细胞移植大鼠创伤性脑损伤中的应用

目的探讨神经干细胞移植创伤性脑损伤（TBI）过程中有效的示踪剂,并进一步观察移植后NSCs的自然存活与分化情况。方法Feeney法制备大鼠TBI模型;将体外培养的NSCs进行PKH26荧光示踪剂标记,并于损伤后第3天移植入脑损伤灶区,对照组注射等量生理盐水。分别于移植后1天、4天、7天及2周、3周、4周、8周取材,行全脑冷冻切片,观察PKH26标记的NSC的自然存活及分布情况;Nestin、βⅢ-微管蛋白和GFAP免疫细胞化学染色观察移植后NSCs的分化。同时,于取材前采用Corner试验进行神经行为学检测。结果PKH26标记NSCs的阳性率＞95%。移植后第1天、4天,NSCs主要分别于注射部位周围,细胞胞体较小,分布均匀,大部分仍为Nestin阳性表达细胞。移植后第7天,移植NSCs可迁移至嗅球、额叶及枕叶皮质等区域。针道及周围组织NSCs分化为神经元和神经胶质细胞的比例分别为12.3％±2.1％和372％±7.6％。移植后第2周,海马、脑桥、小脑普肯耶细胞层等广泛区域均可见移植细胞。移植后第4～8周,移植细胞存活数量呈减少趋势。移植细胞的PKH26染色未见明显减弱。同一时间段内,与对照组相比,NSCs移植组动物的感觉运动功能均有明显改善。结论PKH26荧光示踪剂可用于体外培养的NSCs脑内移植示踪观察。移植NSC于损伤灶区,可自然分化为神经元和神经胶质细胞,并可迁移至脑内多处远距离部位,能明显改善TBI动物的感觉运动功能。     

神经干细胞移植治疗大鼠脑外伤

已有报道表明神经干细胞移植可在一定程度上恢复受损中枢神经系统的功能[1,2],其治疗机制是通过移植入宿主体内的神经干细胞在中枢神经系统损伤部位定居、增殖并分化成具有修复神经损伤功能的神经元和神经胶质细胞等,同时这些分化的神经元应能与周围神经系统建立起正确的突触联系[3]。     

叶酸联合成体神经干细胞治疗创伤性脑损伤大鼠的实验

目的观察叶酸联合成体神经干细胞对创伤性脑损伤大鼠的治疗作用,探讨其可能作用机制。方法 120只Wistar大鼠随机分为6组,正常组,模型组,假手术组,叶酸注射组,成体神经干细胞移植组,成体神经干细胞移植+叶酸注射组。倒置显微镜下观察神经干细胞形态学变化;流式细胞仪检测神经干细胞表面标记物CD105、CD45、CD44、CD29的表达;免疫荧光法检测神经元特异性烯醇酶(NSE成熟神经元的特异性标志)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP胶质细胞的标记物)的表达;平衡木实验检测大鼠运动协调与整和能力;Morris水迷宫实验测试各组大鼠的学习记忆能力;HE染色及Brdu免疫组化实验观察脑组织形态学变化;酶联免疫吸附试验检测大鼠脑组中脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)的表达;蛋白质印迹法检测脑组织中凋亡相关蛋白BCL-2、Bax、Caspase-3的表达。结果分离所得细胞能在体外传代培养,流式细胞仪检测发现细胞阳性表达CD44、CD29,阴性表达CD105、CD45,细胞经胎牛血清诱导分化后能形成NSE或GFAP阳性细胞。实验表明,叶酸与成体神经干细胞干预创伤性脑损伤大鼠模型后能显著改善其行为学变化,减轻脑组织的炎症反应,恢复受损神经细胞,增加脑组织内BDNF、NGF的含量,上调BCL-2的表达,下调Bax、Caspase-3的表达。结论叶酸联合成体神经干细胞干预创伤性脑损伤大鼠能显著改善中枢神经功能,对维持神经元微环境稳态具有重要的作用。     

荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞移植对脑损伤大鼠认知功能及神经生长因子表达的影响

目的 建立大鼠自由落体颅脑损伤动物模型,并探讨静脉内注射神经干细胞(NSC)对大鼠脑损伤后神经功能恢复及NGF表达的影响.方法 采用仿Feeney自由落体脑损伤装置,用50 g的击锤沿导引杆从30cm高处自由坠落冲击撞杆,造成大鼠右顶叶皮质运动感觉区脑挫裂伤,24h后通过大鼠尾静脉移植GFP转基因小鼠NSC,1周后行神经功能评分并行NGF免疫组织化学染色.结果 NSC移植后1周,移植细胞在损伤区域聚集;NSC移植组认知功能评分和NGF阳性细胞数[(226±27)分,(23±4)个]与单纯脑损伤组[(300±36)分,(15±3)个]比较差异有显著性(P＜0.05).结论 NSC移植明显促进脑损伤大鼠认知功能恢复,NGF可能是修复机制中的一个重要分子.     

神经干细胞联合神经营养因子-3基因修饰的嗅鞘细胞移植对创伤性脑损伤大鼠神经功能的影响及机制

目的 探讨神经干细胞(NSCs)与神经营养因子-3(NT-3)基因修饰的嗅鞘细胞(OECs)联合移植对大鼠创伤性颅脑损伤(TBI)后神经功能的影响及机制。方法 将100只Sprague Dawley雄性大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组,每组20只。模型组、NSCs组、OECs组、联合治疗组大鼠采用改良Feeney法构建TBI模型。造模1 d后,将不同的试剂注入各组大鼠损伤灶进行细胞移植,模型组大鼠注入10μL生理盐水,OECs组大鼠注入10μL NT-3基因修饰的OECs悬液,NSCs组大鼠注入10μL NSCs悬液,联合治疗组大鼠注入5μL NT-3基因修饰的OECs细胞悬液和5μL NSCs悬液,注射完成后继续常规饲养。分别于移植后1、7、14、28 d,各组随机取10只大鼠,采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评估各组大鼠的神经功能缺损程度。移植后7 d,采用酶联免疫吸附试验法检测大鼠脑组织中白细胞介素(IL)-6、IL-1β及神经生长因子(NGF)水平。移植后28 d,采用苏木精-伊红染色法观察大鼠脑组织病理学改变,采用免疫组织化学染...     

神经干细胞移植在缺血性脑损伤治疗中的应用

20世纪90年代以来,神经干细胞（neural stem cell,NSC）相继从胚胎和其他成体哺乳动物的中枢神经系统分离培养成功,“中枢神经系统受损后不能再生”的传统观点被打破,这为中枢神经系统疾病的治疗提供了新途径。NSC的研究成为神经科学领域研究的热点。NSC能分化为神经元和神经胶质细胞,参与脑组织结构和功能的修复,还可作为基因修饰载体用于中枢神经系统疾病的基因治疗。     

磁性纳米粒标记的神经干细胞不同移植途径对大鼠脑损伤治疗的实验研究

目的 探讨脑损伤后不同移植途径神经干细胞的迁移及分布情况并进行对比研究.方法 体外培养的胚胎神经干细胞,采用Feeney自由落体脑创伤模型制成大鼠脑损伤模型,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)标记神经干细胞,并将其分别经枕大池穿刺注射入脑损伤大鼠蛛网膜下腔的脑脊液中及经立体定向脑内注射移植,分别进行大鼠运动功能缺失的神经功能评价、磁共振示踪及大鼠脑切片普鲁士蓝染色.结果 接受神经干细胞移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高(P<0.05),两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别.接受神经干细胞移植的两组大鼠神经运动功能评分均较损伤对照组明显提高(P<0.05),两移植组大鼠神经运动功能评分无明显差别.标记组移植经枕大池移植的神经干细胞即刻的MRI即可观察到大鼠脑内的移植标记细胞,移植后2周脑挫伤即可见到低信号影,组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符.结论 经枕大池移植的神经干细胞具有远距离迁移能力,并能像脑内移植一样明显有助于大鼠神经运动功能的恢复.用MRI活体示踪移植磁化标记神经干细胞在TBI模型大鼠脑内迁移和分布是可行的.     

脑损伤的修复与神经干细胞移植的研究进展

中枢神经系统受损后再生非常困难。传统观点认为，“神经组织损伤不能再生”，“成年动物神经细胞不能分裂”、“哺乳运动中枢神经系统的神经元只产生于胚胎期及出生后不久的一段时间，其后神经元的分裂即告结束”。因此，当中枢神经系统由于创伤、缺血及变性疾病等原因造成大量神经元缺失时，因不能产生新的神经元，建立新的突触联系，     

移植的神经干细胞在脑损伤区壳聚糖载体中的存活与分化

目的:探讨移植的NSCs在大鼠脑损伤区壳聚糖载体中的存活、分化情况及其对TBI大鼠认知功能的影响。方法:低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs扩增、标记BrdU。Feeney法制备SD大鼠TBI模型,随机分为3组:损伤对照组清创后不做移植;NSCs 支架移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植;NSCs 支架 NGF移植组行壳聚糖作载体的NSCs移植,并在其中加入NGF。术后1、2、3个月行避暗回避和跳台试验。脑切片行Nissl染色、BrdU与NF-200免疫荧光双标染色。结果:两移植组的认知功能在术后1、2、3个月较损伤对照组明显改善,含NGF的移植组改善更加显著。两移植组术后1、2、3个月在移植区均可见BrdU与NF-200免疫荧光双标细胞,含NGF移植组中的双标细胞数量多、胞体大、突起多且长。结论:大鼠TBI后移植的外源性NSCs可以在脑损伤区壳聚糖载体中长期存活并向神经元分化,可以改善大鼠的认知功能;NGF对其具有促进作用。     

人神经干细胞移植治疗大鼠脑创伤观察

目的:探讨人神经干细胞(NSCs)移植治疗大鼠脑创伤的可行性.方法:取孕14周流产胎儿脑组织,进行NSCs培养及鉴定,并应用Hoechest33258标记细胞.54只大鼠随机等分为假损伤组(A组)、治疗对照组(B组)及NSCs移植组(C组).采用自由落体撞击法制作大鼠脑创伤模型后,C组给予NSCs移植,B组给予生理盐水,A组不打击脑组织.3组分别于移植术后2 d及7 d进行大鼠行为学评分,分别于植术后2周和4周行Y迷宫试验测学习和记忆评分.移植后3 d、7 d脑组织切片荧光显微镜下观察移植细胞存活情况,移植后2周、4周行GFAP、NSE免疫组织化学染色.结果:NSCs移植后2 d行为学评分3组之间差异有统计学意义(P=0.00),B、C组间差异无统计学意义(P=0.09);移植后7 d行为学评分3组间差异有统计学意义(P=0.00),A、C组间差异无统计学意义(P=0.10);移植后2周学习评分和4周记忆评分3组间差异均有统计学意义(P=0.00),B、C组间差异均有统计学意义(P=0.00);C组脑组织GFAP、NSE染色阳性,可见标记的NSCs.结论:人NSCs植入大鼠创伤脑内后,可存活并和宿主组织融合在一起,促进大鼠行为学恢复,提高学习和记忆能力,并分化为神经元和神经胶质细胞.NSCs移植为治疗脑创伤提供了新的方法.     

锰增强磁共振示踪移植神经干细胞在大脑内的功能

背景：在前期研究中,我们已成功用SPIO标记成人神经干细胞（NSCs）,移植到开放性脑外伤患者脑内,并用MRI观察到其在脑内的迁徙和分布,实现了无创性观察移植NSCs在体内的分布。但是这一方法无法评估移植NSCs是否参与大脑功能活动。在本实验中,我们利用锰增强磁共振（ME-MRI）技术在体观察移植NSCs在动物脑损伤区的功能活动。 方法：40只脑损伤SD大鼠随机分为四组,每组10只大鼠。第1组大鼠脑损伤后不行NSCs移植,然后行ME-MRI扫描。静脉输注MnCl2.4H2O,甘露醇开放一侧血脑屏障,电刺激其对侧前肢,采用3D-SPGR序列ME-MRI扫描。第2组大鼠脑损伤一周后行SPIO标记NSCs立体定向移植,两周后行ME-MRI扫描,方法同前。第3组大鼠脑损伤一周后行SPIO标记NSCs立体定向移植,两周后行ME-MRI扫描,方法同前,但在电刺激阶段静脉注射钙通道阻滞剂地尔硫卓。第4组脑损伤大鼠局部注射PBS,然后行ME-MRI扫描,方法同前。 结果：第2组脑损伤大鼠ME-MRI扫描后发现相应的皮层有高信号,表明局部存在神经细胞电活动,并为ME-MRI所反映。第3组脑损伤大鼠加入地尔硫卓后其相应位置的高信号消失,表明这一电活动是钙通道依赖性的。而第1组和第4组脑损伤大鼠脑损伤区无高信号出现。 结论：我们利用ME-MRI可初步检测到移植NSCs在大脑局部的电活动,为今后进一步研究NSCs在宿主脑内的功能奠定了基础。     

胚胎神经干细胞移植对大鼠脑创伤后认知功能障碍的影响

目的 探讨脑创伤后胚胎神经干细胞移植对大鼠认知功能障碍的影响。 方法 成年雄性SD大鼠80只,随机平均分成4组:对照组、脑创伤组、脑创伤神经干细胞移植组和脑创伤PBS移植组。应用免疫组织化学方法 观察伤后移植细胞在体内的分布和迁移,同时检测海马局部脑组织中神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)的表达;采用Morris水迷宫实验评价大鼠伤后的空间学习记忆能力。结果 神经干细胞移植后7、14、21和28 d,移植区可检测到BrdU标记的阳性细胞。移植后7、14 d时神经干细胞移植组伤后海马及周边局部脑组织中NGF的光密度(IOD)值分别为0.495 4±0.013 4、0.576 7±0.021 1,BDNF的IOD值分别为0.474 5±0.042 5、0.556 3±0.032 1,较其他组增高(P<0.05);神经干细胞移植组各时间点搜索安全岛逃避潜伏期较脑创伤组和PBS移植组有改善 (P<0.05)。 结论 胚胎神经干细胞移植后海马局部脑组织中神经营养因子表达发生改变,对伤后认知功能障碍的恢复有着重要作用。     

神经干细胞移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤大鼠神经功能恢复的影响

目的:探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植联合PEP-1-SOD1对颅脑损伤后大鼠神经功能恢复的影响?方法:SD雄性大鼠80只,建立颅脑损伤模型后随机分为4组:对照组(损伤处注入生理盐水)?NSCs移植组(损伤处注入NSCs悬液)?SOD1组(损伤处注入PEP-1-SOD1蛋白)及NSCs+SOD1组(损伤处注入NSCs 悬液+PEP-1-SOD1蛋白)?4 d后采用定量PCR及Western blot法分别检测小鼠脑组织中AQP4基因表达及蛋白合成变化;分别于损伤后1?3 d和1?2?3?4周行Bederson评分,损伤后23~28 d行Morris水迷宫试验对大鼠运动神经功能进行评价;伤后第4周取材行病理切片BrdU 免疫组织化学染色?结果:脑损伤后4 d,对照组脑损伤周围组织AQP4及其mRNA的表达高于NSCs移植组及SOD1组,NSCs移植组及SOD1组均高于NSCs+SOD1组(P < 0.05)?分别于损伤后1?3 d及1?2?3?4周行Bederson评分显示4周时各组大鼠Bederson评分均低于24 h,并且4周时Bederson评分NSCs+SOD1组低于对照组(P < 0.05)?Morris 水迷宫试验结果显示NSCs+SOD1组神经功能改善较对照组明显(P <0.05)?免疫组化染色结果显示NSCs+SOD1组大鼠损伤灶脑组织中的BrdU 阳性细胞数高于NSCs移植组?SOD1组和对照组(P <0.05)?结论:神经干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能,联合应用PEP-1-SOD1有协同效果?     

Detection of neural stem cells function in rats with traumatic brain injury by manganese-enhanced magnetic resonance imaging

Background  Previously we had successfully tracked adult human neural stem cells (NSCs) labeled with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) in host human brain after transplantation in vivo non-invasively by magnetic resonance imaging (MRI). However, the function of the transplanted NSCs could not be evaluated by the method. In the study, we applied manganese-enhanced MRI (ME-MRI) to detect NSCs function after implantation in brain of rats with traumatic brain injury (TBI) in vivo.

Methods  Totally 40 TBI rats were randomly divided into 4 groups with 10 rats in each group. In group 1, the TBI rats did not receive NSCs transplantation. MnCl₂∙4H₂O was intravenously injected, hyperosmolar mannitol was delivered to disrupt rightside blood brain barrier, and its contralateral forepaw was electrically stimulated. In group 2, the TBI rats received NSCs (labeled with SPIO) transplantation, and the ME-MRI procedure was same to group 1. In group 3, the TBI rats received NSCs (labeled with SPIO) transplantation, and the ME-MRI procedure was same to group 1, but diltiazem was introduced during the electrical stimulation period. In group 4, the TBI rats received phosphate buffered saline (PBS) injection, and the ME-MRI procedure was same to group 1.

Results  Hyperintense signals were detected by ME-MRI in the cortex areas associated with somatosensory in TBI rats of group 2. These signals, which could not be induced in TBI rats of groups 1 and 4, disappeared when diltiazem was introduced in TBI rats of group 3.

Conclusion  In this initial study, we mapped implanted NSCs activity and its functional participation within local brain area in TBI rats by ME-MRI technique, paving the way for further pre-clinical research.

     

人脐血间质干细胞移植对脑创伤大鼠行为学和学习、记忆评分的影响

目的:研究人脐血间质干细胞(UCB-MSCs)移植对脑创伤大鼠的行为学和学习、记忆评分的影响.方法:健康孕妇顺产脐血经分离、培养得到的UCB-MSCs,移植于自由落体撞击法制作的脑创伤模型大鼠受损脑组织内.分别于移植后2d及7d进行大鼠行为学评分,2周和4周行Y迷宫试验.结果:移植后2 d、7 d 2组组内行为学评分比较差异有统计学意义(P＜0.05);移植后2周学习评分和4周记忆评分2组间差异亦均有统计学意义(P＜0.05).结论:UCB-MSCs移植治疗脑创伤大鼠可提高其学习和记忆能力.     

神经干细胞移植联合促红细胞生成素对大鼠脊髓损伤的修复作用

目的:观察神经干细胞(NSCs)联合促红细胞生成素(EPO)对横断性大鼠脊髓损伤的修复作用,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:40只成年雌性Wistar大鼠建立大鼠T10全横断脊髓损伤模型,并随机分为对照组、NSCs组、EPO组和NSCs+EPO组,每组10只。术后8周采用NF-200免疫组织化学染色和免疫荧光染色对各组大鼠损伤区脊髓神经纤维再生情况进行形态学观察;应用BBB评分评估各组大鼠后肢运动功能恢复情况。结果:组织形态学观察,对照组大鼠横断处脊髓组织残端萎缩,脊髓白质和灰质间可见大量空洞形成,未见有明显的神经纤维再生;NSCs+EPO组大鼠横断处脊髓组织残端轻度萎缩,横断区可见大量呈杂乱、无序生长的神经纤维,可见有连续性神经纤维通过脊髓横断区,脊髓白质和灰质间可见少量空洞形成。NSCs+EPO组大鼠中,FITC共轭抗神经丝蛋白抗体NF-200标记的再生神经纤维在横断区头侧大量再生,呈无序状生长,并通过损伤区到达尾侧;NSCs组大鼠可见少量神经纤维再生,未通过损伤区到达尾侧。NSCs+EPO组大鼠后肢运动功能BBB评分,术后7 d内均高于其他各组(P<0.05);NSCs组大鼠后肢运动功能BBB评分术后7 d内均高于对照组和EPO组(P<0.05)。结论:NSCs移植联合腹腔注射EPO可有效促进大鼠损伤脊髓功能的恢复、轴突的存活和再生。     

骨髓间质干细胞对大鼠脑损伤后血管再生的影响

目的：探讨骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)对大鼠颅脑损伤后血管再生的影响。方法：自由落体法建立大鼠脑撞击伤模型,50只Sprague-Dawley大鼠随机分为移植组和对照组,每组25只。移植组大鼠手术后12 h侧脑室注射法移植BM-MSCs,对照组仅注射生理盐水。术后第 1,3,7,14和21天行改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological deficit scores of rats,mNSS)。于术前,术后3,6,12,24 h和3,7 d采用流式细胞仪检测大鼠外周血CD34和CD133抗体双标记细胞。免疫组织化学SP法检测损伤周围脑组织CD31和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)的表达。结果：两组间mNSS分值差异有统计学意义(F=5.997,P<0.05),组内不同时间点间差异也有统计学意义(F=37.106,P<0.01)。术后第7,14,21天对照组较移植组 mNSS评分高,差异有统计学意义(均P<0.05)。大鼠外周血中存在CD34和CDl33双阳性细胞表达。对照组大鼠外周血中CD34和CDl33双阳性细胞数伤后3 h为下降状态,后升高,伤后6 h达最高点,此后逐渐下降,伤后24 h降至正常水平。移植组有同样的趋势,CD34和CDl33双阳性细胞升高持续到伤后24 h,其数量明显高于对照组(P<0.05)。术前两组NSE均有阳性表达,术后7,14 d时移植组的NSE表达显著高于对照组(P<0.05)。术前两组CD31的阳性表达很少,术后3,7 d时移植组的CD31表达显著高于对照组(均P<0.05)。结论：BM-MSCs移植可以增加脑创伤后大鼠外周血中内皮祖细胞数量并持续约24 h,可以调高大鼠脑创伤后损伤周围区的血管生成标志物的表达和神经元标志物的表达。BM-MSCs移植组大鼠脑损伤后神经功能较对照组改善明显。     

脑外伤后不同时间移植神经干细胞的疗效对比研究

目的通过观察脑外伤后不同时间移植神经干细胞的疗效，探讨脑外伤后进行神经干细胞移植的最佳时机。方法将成年大鼠制成脑外伤模型，分别在伤后即时、24h、48h三个时点进行神经干细胞移植，治疗后比较其行为学、流式细胞仪计数、免疫组化染色、电镜观察等指标。结果移植组较对照组各项指标均有改善，24h移植组在流式细胞仪计数、免疫组化染色、电镜观察等指标上较其他各组改善更加明显（P〈0．05），而行为学改善与其他实验组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论脑外伤后24h是进行神经干细胞移植的适宜时间。