小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞培养方法,为有关肾损伤体外研究提供实验平台。方法 分别采用肾小管节段贴块法、胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ法消化分离肾小管节段,用含10%血清的培养基培养,然后用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,对原代和传一代肾小管上皮细胞进行鉴定。结果 三种培养方法培养细胞3 d基本贴壁,胶原酶Ⅰ法3-4 d长满瓶底,肾小管节段贴块法4-5 d长满瓶底,胰蛋白酶7 d左右。细胞均鹅卵石铺路样生长,经细胞免疫组织化学染色鉴定cytokeratin 18呈阳性。结论 肾小管节段贴块法和胶原酶Ⅰ消化都可以得到较理想的肾小管上皮细胞,后者细胞生长较快,为研究肾损伤的发生原因和机制提供实验基础。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的:建立一种良好的SD大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法:选用4周龄SD幼鼠的肾皮质进行细胞培养,采用机械研磨、胰酶消化、过滤,Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养及传代。制作细胞爬片,用免疫细胞化学(Cytokeratin 18表达阳性)进行鉴定。结果:肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周生长,4~5 d后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石样,透明度及折光性强。结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代培养及传代的细胞98%以上为肾小管上皮细胞。结论:采用此方法分离培养的肾小管上皮细胞数量多,均一性生长佳,可重复性操作良好。     

SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

目的：探讨大鼠肾小管上皮细胞的体外培养及鉴定方法,为肾结石病的研究提供实验平台。方法：采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段,在含10%胎牛血清和1%上皮细胞生长因子的上皮细胞培养基中培养,0.25%胰蛋白酶消化后传代培养,并用原代和传1代细胞做免疫细胞化学染色鉴定。结果：细胞培养至第3天完全贴壁,4～7d处于对数生长期,为多边鹅卵石样;免疫细胞化学染色显示cytokeratin18表达阳性。结论：机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法结合使用上皮细胞培养基可以培养得到较纯的肾小管,是大鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法,为进一步研究泌尿系结石病因和机制提供了实验基础。     

微分离方法原代培养大鼠肾近曲小管上皮细胞

目的建立比较理想的大鼠肾近曲小管上皮细胞的原代培养及鉴定方法。方法采用显微微分离单根肾近曲小管节段的方法进行原代培养,并用免疫细胞化学方法和电镜进行鉴定。结果用微分离方法成功地培养出肾小管上皮细胞,经鉴定为该细胞。结论微分离方法是大鼠肾近曲小管上皮细胞原代培养的有效方法。     

人肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 :建立人肾小管上皮细胞原代培养、传代、冻存及鉴定方法。方法 :采用肾小管节段贴块培养法 (A法 )与消化培养法 (B法 )对比原代培养 ,并以 0 .2 5 %胰蛋白酶消化、传代 ,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类 ,常规冻存和复苏。结果 :A法成功培养、传代、冻存、复苏并鉴定了人肾小管上皮细胞 ,B法失败。结论 :肾小管节段贴块培养法用于人肾小管上皮细胞原代培养是可行的     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法.方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代.取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构.结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成.细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性.细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密.结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系.     

人近端肾小管上皮细胞的原代培养

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。     

人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究

目的:创建一种重复性好、细胞量多的人肾近端小管细胞(PTC)培养方法。方法:取新鲜正常人肾组织分离纯化,用含10%新生牛血清等营养充分的DMEM/F12(1∶1)液进行近端小管细胞的原代培养及传代,并以免疫组化、酶化学染色、透射电镜鉴定。结果:培养5~6天后融合成单层细胞,形态呈鹅卵石样,可传代7~9代,鉴定确定为人肾近端小管细胞,重复培养10次,均能稳定获得同样细胞,每克肾皮质可分离培养出(6~12)×106个PTC。结论:此培养方法可在7天内获得人肾近端小管细胞,且重复性好,细胞数量多,为进行肾小管细胞治疗提供必需的细胞,也为研究肾小管病变提供实验平台。     

构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法

目的：建立可靠稳定的小鼠肺泡Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)的分离、原代培养技术,为进一步研究AECⅡ转分化分泌生长转化因子β1(TGF-β1)等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。方法采用传统的方法和改良后方法分别提取20只小鼠AECⅡ,将其所提取的细胞数量进行对比。结果传统组小鼠可获得(4.21±2.31)×106个,改良组小鼠可获得(13.0±2.20)×106个,差异有统计学意义(P<0.05),而两组小鼠在体质量、年龄以及肺组织重量方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论此改良方法可成功获得大量稳定的AECⅡ,为进一步研究AECⅡ转分化分泌TGF-β1等物质与乳腺癌休眠细胞激活的相关机制奠定基础。     

新生大鼠Ⅰ型肺泡上皮细胞原代培养方法的改进

【摘要】 目的 改进体外SD大鼠Ⅰ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅠ,ATⅠ)的原代培养方法,用更为简单的培养方法获得较高纯度的ATⅠ。方法 选用新生1d的SD大鼠,消毒后待新生大鼠呼吸停止后断头取肺,采用胶原酶Ⅰ和DNaseⅠ消化分离法获取原代细胞,将细胞接种在Ⅰ型鼠尾胶原蛋白包被过的细胞板中,利用差速贴壁法纯化AT Ⅰ,同时细胞培养48 h后进行换液,倒置显微镜下观察细胞的生长状态,用细胞水通道蛋白5（AQP5）、肺表面活性物质相关蛋白（SPC）、植物凝集素（BSI）、波形蛋白（Vimentin）4种肺细胞的特异性表达产物鉴定细胞。结果 接种2 d时,细胞开始贴壁生长。4～6 d时细胞开始增殖,呈现梭形、立方形、多角形等多种形态。8 d时细胞增殖能力达到最大,细胞活力为（87±8）%,细胞纯度为（87±5）%。结论 对组织取材、分离和培养进行改进可获得产量高、生长状态好、纯度高的ATⅠ。     

Percoll法分离培养肾小管上皮细胞

目的建立良好的肾小管上皮细胞培养方法。方法选用SD幼鼠的肾组织进行细胞培养，采用Percoil密度梯度离心法分离纯化肾小管后，选择含10％新生牛血清的DMEM／F12培养基、5％CO2、37℃孵箱进行细胞培养。利用传1代的细胞，制作细胞爬片，用免疫组化、透射电镜进行鉴定。结果细胞生长4—5天后基本达到融合，细胞呈多边鹅卵石铺路样。结合形态学及免疫组化鉴定，细胞培养传1代后98％的细胞为肾小管上皮细胞。结论用Pereoll法分离培养的细胞数量多，均一性生长较好，可重复性操作较好。为体外研究接近组织原位RTECs细胞功能和特征及药物的筛选提供了可行性和可能性。     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法.方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代.在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色.结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞.结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长.     

肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化

目的探讨肾组织干细胞向肾小管上皮细胞的诱导分化。方法分离肾乳头肾组织干细胞,对照组加入正常干细胞培养
基,诱导组应用含activin A、BMP-7、维甲酸3种细胞因子的诱导培养基与肾上皮细胞培养基交替诱导,同时与缺氧损伤的肾小
管上皮细胞共培养,通过细胞流式、免疫荧光、qRT-PCR的方法评估诱导效率。结果细胞流式结果提示,对照组肾组织干细胞
CK-18阳性率为6.5%,诱导组CK-18阳性率为44.2%;免疫荧光结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记CK-18、E-cadherin、ZO-1部
分阳性表达;qRT-PCR结果提示,诱导组成熟上皮细胞标记E-cadherin、AQP-1基因表达水平较对照组显著升高（P<0.01）。结
论肾组织干细胞在体外可以诱导分化为肾小管上皮细胞。
     

创伤性急性肾衰时肾脏分离肾小管上皮细胞DNA损伤的意义

目的探讨肾小管上皮细胞DNA损伤在急性肾功能衰竭（acute renal failure,ARF）中的意义。方法Wistar大鼠108只,等分为大、小剂量及对照组,分别于后肢肌肉注射10、5ml／kg50％甘油及10ml／kg生理盐水。于1、3、6、12、24、48h测定血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（creatinine,Cr）,取肾脏分离肾小管上皮细胞,单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）技术测定DNA损伤。结果两实验组BUN、Cr分别于12、6h起较对照组显著升高（P＜0．05,P＜0．01）,两实验组间BUN和Cr分别在12h和24h起出现显著差异（P＜0．05,P＜0．01）,表明肾功能受损程度不同。肾脏分离肾小管上皮细胞DNA损伤对甘油注射呈现剂量和时间依赖性,其变化趋势与尿脱落细胞DNA损伤相似,但损伤程度较轻。结论DNA损伤、细胞脱落及凋亡等变化参与了肾小管上皮细胞的损伤,是ARF病理生理变化过程“多米诺骨牌”中的重要环节,在预防或及时阻断其发生在ARF的救治中有重要意义。     

Experimental Study on Detached Renal Tubular Epithelial Cells in Urine of Nephropathia Epidemic Patients

Acuterenalfailure(ARF)isthecom-monestclinicalfeatureofnephropathiaepi-demic(NE).SeverityofrenallesionandtherapeuticeffectsdirectIydictatethecourseand-aftermathofNEpatients.ToimprovetheprophylaxisandtreatmentofARF,itisimperativetobetterunderstandpathogenesisofARF.Thoughitiswellknownthatdirectdamagebyvirus,sec-ondaryimmunedisturbanceandinflamma-tionmediatorsareinvolvedinthepathogen-esis,therehasbeennoevidenceshowingthatHantanViruscoulddirectlydamagere-naItubularepithelialcells(RTECs).Pr…     

右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的影响

目的观察右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）表达的影响,并探讨其可能的机制。方法购买大鼠肾小管上皮细胞,经复苏、培养,均加入10μg/L脂多糖,均经培养后分为3组。A组为空白对照组;B组为阳性对照组,加入右美托咪啶2.5μg;C组作为实验组,先加入阿替美唑10μg,30 min后加入右美托咪啶2.5μg。继续培养12 h。采取免疫组织化学法检测3组细胞TLR4表达及TLR4mRNA水平,并测定3组细胞凋亡率。结果B组应用右美托咪啶后,TLR4、TLR4mRNA和细胞凋亡率均低于A组（P<0.01）;C组TLR4、TLR4mRNA和细胞凋亡率均高于B组（P<0.01）。结论右美托咪啶可下调脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达,且右美托咪啶对TLR4的调节与α₂肾上腺素能受体被激动相关。     

肾小管上皮细胞转分化在高脂血症大鼠肾损害中的作用

目的 探讨肾小管上皮细胞转分化在脂质肾损害发病中的可能作用。方法 用含4%胆固醇和1％胆酸钠的高脂饲料饲喂大鼠建立高脂模型，观察大鼠血脂、尿蛋白、血肌酐和肾间质病理改变，并用免疫组化技术检测肾小管上皮细胞a-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、角蛋白的表达。结果 高脂大鼠血脂、尿蛋白和血肌酐升高，肾间质出现明显病理改变，免疫组化显示肾小管上皮细胞α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白表达增高，角蛋白表达下调。结论 肾小管上皮细胞转分化在促进脂质肾损害发生发展的过程中起重要作用。     

大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定及其增殖活力分析

目的：建立一种大鼠肾小管上皮细胞的分离鉴定方法,分析所获得细胞的增殖活力,为肾损伤等肾脏疾病的体外分析实验提供理论基础和技术支持。方法：采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肾小管节段,并用Percoll密度梯度离心法进一步纯化肾小管,常规条件下对肾小管节段进行贴壁培养,待细胞爬出后,用免疫组织化学方法检测细胞角质素-18（CK-18）的表达情况,采用流式细胞术对第0、1和2（P0、P1、P2）代细胞的CK-18表达情况进行分析,用CCK-8方法检测各代细胞的增殖活力。结果：肾小管节段培养24 h后,可见细胞从节段内爬出;培养72 h后,细胞呈铺路石样密集生长。随着传代进行,P0、P1和P2代细胞CK-18的表达效率分别为95.9%、91.5%和76.8%,肾小管上皮细胞逐渐死亡,P2代细胞较P1代细胞增殖活力明显减弱(P<0.05),同时培养体系中杂细胞增多。结论：该方法经济可靠、简便易行,但是所分离的肾小管上皮细胞只可在体外传代2次,不能长期培养,仅P0、P1代细胞可供体外分析实验使用。     

马兜铃酸对人肾小管上皮细胞损伤的体外实验研究

目的 研究马兜铃酸(aristoloehie acid,AA)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)的损伤及可能机制.方法 将细胞分为4组:正常对照组与AA30、60、120 μmol/L组(n=6),分别作用于HK-2细胞培养48 h后,倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK8试剂盒(Cell Counting Kit-8)检测增殖,流式细胞仪检测凋亡,Western blot分析激活型Caspase-3的表达,全自动生化检测仪测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和B-N-乙酰氨基匍萄糖苷酶(NAG酶)的含量,激光共聚焦扫描荧光显微镜(Laser scanning eonfocal microscope,LSCM)观察α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle aetin,α-SMA)和E-钙黏连蛋白(E-cadherin)的表达,ELISA测定上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Ⅲ型胶原的分泌.结果 HK-2分别在30、60、120 μmoi/L AA作用48 h后,出现增殖抑制,凋亡增加,激活型Caspase-3表达增多,LDH和NAG酶升高,均旱剂量依赖性.60μmol/1.浓度的AA还表现E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增强,TGF-β1和Ⅲ型胶原分泌明显增加(P<0.05).结论 AA可引起HK-2细胞明显的增殖抑制、凋亡和上皮-间允质转分化呈一定的浓度依赖性.     

肾损伤分子-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用

目的 观察肾损伤分子-1(KIM-1)对肾小管上皮细胞缺氧损伤时增殖及凋亡的影响,证实KIM-1对肾缺氧损伤的保护作用.方法 以人近端肾小管上皮细胞HK-2为研究对象,用pcDNA-hKIM-1质粒转染HK-2细胞,获得稳定表达KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株.观察pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(A组)和KIM-1抗体预处理pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(C组)在缺氧损伤后细胞活力、凋亡指标及凋亡相关信号分子表达,以未转染缺氧HK-2细胞(B组)作为对照.结果 A组细胞活力指数高于B组(0.427±0.046 vs.0.210±0.036,P＜0.05),细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、晚期凋亡指数明显低于B组(P＜0.05).A组细胞缺氧时磷酸化ERK、磷酸化Akt表达较C组明显升高(P＜0.05).结论 KIM-1对肾小管上皮细胞缺氧损伤具有保护作用,其机制与激活PI3K-Akt/PKB和ERK信号通路抑制凋亡有关.