CCR7基因转染对小鼠未成熟树突状细胞成熟及迁移功能的影响

熟转化,但IL-10可抑制成熟;流式结果表明转染后细胞表型符合典型imDCs的特征;Western blot证实CCR7重组腺病毒转染imDCs后可增强CCR7的表达;体外趋化实验显示转染后imDCs体外迁移百分比由4.2%增加到36.1%.结论 CCR7重组腺病毒转染imDCs后,其仍保留末成熟特性,CCR7蛋白表达增强,体外迁移能力明显增强.     

雷帕霉素联合未成熟树突状细胞诱导小鼠皮肤移植免疫耐受

目的 研究雷帕霉素联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的协同作用.方法 健康雄性C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠分别为供者、受者,建立同种异基因皮肤移植模型.对照组术前术后未给予任何免疫干预措施;雷帕霉素组术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃;未成熟树突状细胞组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7天经尾静脉输注给受者;联合组将供者骨髓来源的未成熟树突状细胞于术前第7d经尾静脉输注给受者,并在术后第0天至第6天给予雷帕霉素灌胃.结果 对照组、雷帕霉素组、未成熟树突状细胞组、联合组的皮肤移植物存活时间分别为(6.9±1.9)、(12.3±3.0)、(17.0±3.4)、(20.8±3.6)d.方差分析提示组间差异有显著性意义(P<0.05);SNK检验提示各组之间的差异均有显著意义.结论 雷帕霉素能延长小鼠皮肤移植物的存活时间;联合供者骨髓来源的未成熟树突状细胞可延长免疫耐受的持续时间.     

N-乙酰半胱氨酸对负载主要组织相容性抗原的树突状细胞生物学特性的影响

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对负载同种异基因MHC抗原的树突状细胞(DC)生物学特性的影响。方法用GM-CSF IL-4定向诱导BALB/c小鼠骨髓细胞分化为DC,观察在负载MHC抗原时加入NAC对DCI-Ad和CD86mRNA的表达和刺激T细胞增殖能力的影响,及其延长同种异基因小鼠皮肤移植物存活时间的效果。结果在NAC作用下,负载MHC抗原的DCI-Ad和CD86mRNA表达水平降低;经NAC处理后,负载MHC抗原的DC刺激T细胞增殖的能力降低;小鼠皮肤移植术前用经NAC处理的负载供者MHC抗原的DC注射到受者体内,可延长移植皮片存活时间。结论NAC可抑制同种异基因MHC抗原对DC的促成熟作用,有利于诱导小鼠皮肤移植免疫耐受。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

建立一种体外诱导培养小鼠骨髓源性的树突状细胞(DCs)方法,在镜下可观察到培养出的未成熟树突状细胞(imDCs)比成熟树突状细胞(mDCs)细胞突起少。流式细胞术检测 CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在 imDCs 的表达显著低于在 mDCs 上的表达。同种异基因混合淋巴细胞反应显示DCs 刺激 T 细胞增殖的能力随着 DCs 所占比例的增大而增强,在相同比例条件下对刺激 T 细胞增殖的能力,imDCs 显著低于成熟 mDCs。该诱导方法可获得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性 DCs。     

BD926对骨髓源性未成熟树突状细胞增殖及吞噬作用的影响

目的 研究苯并噻唑类衍生物BD926对小鼠骨髓源性未成熟树突状细胞(immature dendritic cells, imDCs)增殖及吞噬作用的影响. 方法 分离小鼠骨髓源性单核细胞诱导imDCs,借助PE/Annexin V凋亡检测试剂盒、CFSE细胞增殖试剂盒以及FITC-葡聚糖,应用流式细胞术检测BD926对imDCs在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)刺激下的细胞存活、细胞增殖以及吞噬作用的影响.结果 与PBS组相比,25 、5 、1 μM 的BD926处理imDCs后,其细胞增殖水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);高、中、低3个剂量组BD926处理后,imDCs与PBS组相比,细胞存活差异无统计学意义 (P>0.05);高、中、低3个剂量组BD926处理后,imDCs与PBS组相比,吞噬作用差异无统计学意义 (P>0.05).结论 BD926在体外可明显抑制GM-CSF刺激的imDCs增殖作用,对imDCs的细胞存活和吞噬作用则无明显影响.     

Wnt5a对成熟树突状细胞诱导初始性T细胞向记忆性T细胞分化的作用

目的:利用负载供者抗原的未成熟或成熟树突状细胞(imDCs或mDCs)体外诱导受者初始性T细胞(TNs)的活化、增殖和分化,并研究Wnt5a基因在这一过程中的可能的作用及其机制。方法:构建高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,转染imDCs。建立同种异体小鼠皮肤移植模型,分选培养受体小鼠的imDCs,mDCs和T_Ns。在96孔板中用负载供者抗原的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/Wnt5a的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/LacZ的imDCs,和正常mDCs与记忆性T细胞(TMs)进行混合淋巴细胞反应。流式细胞术检测T_Ns向T_Ms分化的情况。ELISA检测共培养上清中IL-2,IL-10,IFN-γ细胞因子的浓度。RT-PCR检测T细胞中Wnt/β-catenin通路相关的基因表达情况。双荧光素酶报告基因检测混合淋巴细胞反应中T_Ns的β-catenin/TCF信号通路转录活性。结果:RT-PCR和免疫荧光检测发现mDCs中的Wnt5a的表达水平显著高于imDCs(P<0.05)。与负载供者抗原的mDCs相比,imDCs组可显著诱导T_Ns向T_Ms的分化,上调IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌(P<0.05)。双荧光素酶报告系统检测显示mDCs共培养TNs可显著增强β-catenin/TCF信号通路转录活性(P<0.05)。此外,imDCs通过转染高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,也显著提高了其诱导TNs向T_Ms的分化的能力,同时也显著活化了Wnt/β-catenin信号通路(P<0.05)。结论 :在负载供者抗原的DCs与受者T_Ns混合淋巴细胞反应过程中,可诱导T_Ms分化形成,其中DCs的Wnt5a基因介导的T_Ns内β-catenin/TCF信号通路转录激活可能是其中一条重要的途径。     

供者未成熟树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受的诱导

目的探讨供者未成熟树突状细胞 (dendritic cells,DC)对同种异体皮肤移植免疫耐受的诱导效果 ,为抗排斥反应治疗提供依据。方法以供者未成熟树突状细胞术前预处理受者 ,或术后联用环孢霉素 (CSA)。根据实验分组对皮肤移植术后移植皮片存活情况观察。结果对照组、未成熟 DC组、未成熟DC联用环孢霉素组 ,其受体存活时间分别为 6 .86± 1.34d、7.5 7± 1.99d、2 2 .4 3± 4 .4 6 d。未成熟 DC组与对照组之间差别无显著性差异 ,而与未成熟 DC联用环孢霉素组有显著性差异 (P<0 .0 0 1)。结论供者未成熟树突状细胞术前预处理移植受体 ,可明显延长移植物存活时间。     

PDL1修饰树突状细胞对大鼠同种异体肾移植存活的影响

目的观察激活负性共刺激信号PD1-PDL1对延长移植肾存活的效能。方法以PDL1Ig基因重组腺病毒为载体,将PDL1Ig基因转入BN大鼠树突状细胞(DC)细胞同时输注受体,以Lewis大鼠为受体,行同种肾移植为转染组,并以未转染DC输注为对照组;观察移植肾存活时间和术后肾功能变化。结果转染组移植肾存活(41±7.6)d,较对照组移植肾存活时间(8.6±1.2)d明显延长;移植组术后血清肌酐较同期对照组明显为低。结论PDL1基因修饰的DC可以明显延长移植肾存活时间。     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

摘要：【目的】探讨经白介素-12（IL-12）基因修饰体外诱导的树突状细胞（DC）后激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫杀伤喉癌细胞的效能。【方法】应用pAdEasy腺病毒表达载体系统构建重组IL-12腺病毒载体;体外诱导分化喉癌患者外周血单个核细胞来源的DC;用IL-12基因转染喉癌抗原致敏的DC,流式细胞仪分析DC表型的变化; ELASA法检测转染组DC分泌IL-12的水平及其刺激的T细胞分IFN-γ因子的水平; MTT法检测DC刺激的T淋巴细胞增殖反应及CTL特异性杀伤喉癌细胞的效能;统计学分析比较转染组与未转染组间的差异。【结果】成功构建IL-12重组腺病毒颗粒。经Ad-12转染的DC后能高表达成熟表面分子标志CD83,CD86,分别为 (60.2±1.8%), (88.9±2.1%)转染后DC疫苗的 IL-12的分泌水平、刺激同源T淋巴细胞增殖能力及其分泌IFN-γ的水平、诱导细胞毒T 淋巴细胞（CTL）对喉鳞癌细胞Hep-2的免疫杀伤能力明显高于未转染组（P<0.05）。【结论】经IL-12基因修饰的喉癌患者外周血单个核细胞来源的DC后其能促进DC成熟,提高其抗原提呈能力,有效的刺激T淋巴细胞增殖,诱导CTL特异性抗喉癌免疫应答。     

重组趋化因子vMIPⅡ对小鼠异体移植皮肤存活时间的影响

目的　观察纯化的重组vMIPⅡ蛋白对小鼠异体皮肤移植免疫排斥反应是否有抑制作用及能否延长移植皮肤的存活时间。方法　pET3 2a为vMIPⅡ克隆基因的表达载体 ,在大肠杆菌中诱导表达出硫氧还蛋白 vMIPⅡ的融合蛋白 (2 6× 10 3 )。经金属离子亲和吸附、肠激酶消化以游离vMIPⅡ、阳离子交换层析等步骤纯化目的蛋白。用体外配体结合实验证实重组vMIPⅡ与趋化因子受体CCR5的结合能力。纯化的vMIPⅡ经尾静脉给药异体皮肤移植小鼠 (昆明鼠 /Balb/c)连续 14d。结果　经纯化可获得高纯度目的蛋白。vMIPⅡ与趋化因子受体CCR5结合的解离常数 (Kd)为 11 5 6± 1 98nmol/L。给药vMIPⅡ的异体皮肤移植小鼠组移植皮存活时间较未注射对照组延长至术后 7天以上。结论　纯化的重组vMIPⅡ对小鼠异体皮肤移植免疫排斥反应有明显的抑制作用 ,能显著延长移植皮的存活时间     

mIL-12基因转染促进小鼠树突状细胞混合淋巴细胞反应

目的 观察ｍＩＬ－１２基因转染的小鼠树突状细胞（ＤＣ）功能的改变。方法 分离小鼠骨髓单个核细胞与ｒｍＧＭ－ＣＳＦ和ｒｍＩＬ－４培养１周,对培养的细胞进行形态学观察,ＦＡＣＳ检测细胞表面ＤＥＣ２０５、ＣＤ８６表达。以ｍＩＬ－１２重组腺病志染培养的ＤＣ,ＥＬＩＳＡ测定培养上清中ｍＩＬ－１２的水平。混合淋巴细胞反应检测转染细胞的功能。结果培养１周后,得到具有典型ＤＣ形态的细胞,以ｍＩＬ－１２重组腺病毒为     

恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, 观察MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的影响。方法 将合成的MyD88RNAi片段与质粒载体连接, 转化进化学感受态的大肠杆菌, 然后进行菌落PCR鉴定、阳性克隆测序及质粒的抽提;然后转染HEK293细胞, 将获得的重组腺病毒进行两轮扩增后进行纯化;用终点稀释法测定腺病毒滴度;Western blot检测MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的作用。结果 阳性克隆PCR鉴定与理论条带一致, 测序鉴定通过, 腺病毒载体转染树突状细胞, Western blot检测显示干扰组MyD88蛋白表达降低。结论 成功构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, MyD88siRNA对恒河猴树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用。     

体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的 采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原. 方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组.经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒.将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰.最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠. 结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达.重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性.重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞. 结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索.     

In Vitro Anti-tumor Immune Response Induced by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Carrying Mutant K-ras Genes

Summary： The specific anti-tumor immune response induced by mouse bone marrow dendritic cells （DCs） lransfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes was investighted. DCs were generated from mouse bone marrow in the presence of rmGM-CSF （3.3 ng/mL） and rmIL-4 （1.3 ng/mL） and detected by FACS, and then transfecled with the recombinant adenovirus encoding mutant k ras gene. The efficacy of transfection and T cell stimulating activity of DCs were detected. CTL activity of the mice vaccinated with DCs was observed. The resuhs showed thai DCs had dendritic veiled morphology. BmDCs highly expressed B7-1（80%）, B7-2（77%）, MHC Ⅱ （70%）, CDllc （65%）, CD40 （70%） and CD54 （96%） with FACS, and no significant difference in the expression was observed before and after the transfection （P〈0.05）. The DCs transfeeled by mutant k-ras gene could significantly stimulate lymphoeytes proliferation as compared with those transfeeted by Ad e or non-modified DCs （P〈0.05）. DC vaccine transfected by mutant k-ras gene could induce CTL activity against Lewis lung cancer, but not against B16. The specific eytotoxicity against Lewis lung cancer in Ad-k-ras/12-transdueed DC group was signifieantly higher than those in the control, vector and non transfeeted DCs groups （P〈0.05）. It was concluded that special antitumor response could be induced by DCs transfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes.     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

腺病毒介导反义RNA抑制HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4表达

目的抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5和CXCR4表达,阻止HIV-1进入靶细胞。方法逆转录聚合酶链反应扩增HIV-1辅助受体基因5'-端cDNA片段,反向插入穿梭质粒中,再与腺病毒基因组骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组质粒在293细胞中包装、扩增得到含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒,分别感染U937细胞和MT4细胞,于感染后24、48和72h及10d时用流式细胞仪检测细胞表面相应受体的表达。并用Boyden小室法检测重组腺病毒感染对细胞趋化活性的影响以及用3H掺入法检测对细胞增殖能力的影响。结果成功获得含有CCR5和CXCR4反义RNA的重组腺病毒,其滴度为5×1011PFU/ml和7×1010PFU/ml。重组腺病毒感染24h后流式细胞仪检测显示,U937细胞表面CCR5的表达率分别为:Ad-antiR51.12%,未感染细胞对照82.10%,Ad-senseR580.94%,Ad-control81%。MT4细胞表面CXCR4的表达率分别为:Ad-antiX41.03%,未感染细胞对照42%,Ad-senseX444%,Ad-control39%。48、72h及10d后Ad-antiR5感染的U937细胞表面CCR5表达率分别为:1.02%、1.26%、1.23%;Ad-antiX4感染的MT4细胞表面CXCR4表达率分别为:1.13%、1.17%、1.22%。感染重组腺病毒后,两种细胞的趋化活性及增殖能力均无改变。结论包含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒可以使细胞表面相应受体表达下降,且重组腺病毒不影响细胞的趋化活性和增殖能力。     

Induction of T-cell immunity against Epstein-Barr virus-associated tumors by means of adenovirally transduced dendritic cells

Background Dendritic cells (DCs) are the most powerful antigen-presenting cells to induce specific T-cell immunity, which plays an important role in the body‘s anti-tumor responses. In this study, we assessed the feasibility and efficacy of inducing T-cell immunity against Epstein-Barr virus (EBV)- associated tumors in vivo using dendritic cells transfected with EBV latent membrane 2A (LMP2A) recombinant adenovirus.Methods Cytokine-activated bone marrow-derived DCs transfected with EBV LMP2A recombin antadenovirus were infused into BALB/c mice. Splenic cytotoxic T-cell responses were evaluated by cytotoxicity and interferon-γ production assays, in vivo immune protection was then assessed in the mice tumor models implanted with tumor cells expressing EBV LMP2A. Results DCs transfected with EBV LMP2A recombinant adenovirus could strongly induce EBV LMP2A-specific cytotoxic T-cell responses and upregulate interferon-y production in vivo. Vaccination using these DCs led to prolongation of overall survival rates in the mice tumor models and retarded tumor growth.Conclusions The results suggest that DCs transfected with EBV LMP2A recombinant adenovirus can serve as a feasible and effective tool for eliciting LMP2A-specific cytotoxic T-cell responses against EBV LMP2A in vivo in the treatment of EBV-associated tumors.     

CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体（Recombinant adenovirus,rAdv）介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体,转染猪树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响;同时,以CTLA4Ig转染小鼠DC细胞,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力（P＜0.01）和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性,IL－2分泌亦受到明显抑制（P＜0.05）;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低（P＜0.05）。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染转皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。     

胰岛素样生长因子-1与血小板源生长因子-AA以及肿瘤生长因子β1基因克隆及其在腺病毒载体中的表达

目的 从正常的人体成骨细胞中克隆IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1三因子的编码蛋白基因,构建上述因子基因的高效表达重组腺病毒,旨在为基因治疗研究提供有效的工具。方法 培养正常人体成骨细胞,提取细胞总RNA,RT—PCR方法获得IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1的编码基因。将这些片段克隆到高效表达腺病毒载体Adeno—X,并经过HEK293细胞的包装,获得成熟的重组腺病毒。Western印迹法检测上述三因子的表达。利用成熟重组腺病毒感染成骨细胞,检测细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性的改变。结果 重组T载体、重组腺病毒DNA和成熟的重组腺病毒体中均可得到IGF-1、PDGF-AA和TGFβ1基因的PCR片段。Western印迹检测到上述3种因子蛋白质的表达。当携带上述3种因子的重组腺病毒感染成骨细胞后,细胞增殖明显增强,ALP活性明显提高。结论 本实验构建的IGF-1、PDGF—AA和TGFβ1因子的高效表达重组腺病毒可以在人体细胞中表达出具有生物活性的蛋白质,获得了较好的基因工具。     

转染肿瘤细胞总RNA的树突状细胞联合CIK细胞抗小鼠肝癌作用的实验研究

目的探讨转染小鼠肝癌H22细胞总RNA的树突状细胞(DC)疫苗体外抗小鼠肝癌的免疫作用。方法提取小鼠四肢长骨骨髓,在rmGM-CSF和rmIL-4体外刺激下增殖分化为DC。制备小鼠脾淋巴细胞,在体外经rmIFN-γ、anti-CD3、rmIL-2和rmIL-1b诱导成为细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞)。制备肝癌H22细胞总RNA,体外转染DC,流式细胞仪检测转染前后的DC表面分子的表达情况。将转染H22细胞总RNA的DC和CIK细胞混合培养制备成为效应细胞,LDH释放法测定效应细胞对小鼠H22细胞、S180细胞的杀伤活性。结果经H22细胞总RNA转染后的DC,其MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子及CD83、CD86表达率明显增高,CD14表达率降低(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其对S180细胞的杀伤率(P<0.05)。转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其他各组效应细胞对H22细胞的杀伤率(P<0.05)。结论转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞具有高效而特异性的体外抗小鼠肝癌免疫作用。