小鼠供体嵌合率定量检测方法的建立及评价

本研究探讨建立小鼠供体嵌舍率（DC）定量检测方法的有效性。模拟小鼠单倍体相合造血干细胞移植模型,以雄性C57BL／6为供鼠,雌性CB6F1小鼠为受鼠,受鼠随机分成两组,分别给予2Gy与6Gy的^60Coγ照射,随后接种供鼠骨髓（BMCs）及脾细胞悬液（SPMNCs）。移植后利用流式细胞术及real—time PCR技术定量检测DC。结果表明：两种方法检测移植后DC时各有优缺点。6Gy组小鼠在移植后DC数〉90％、且此状况稳定存在3月以上,采用FCM法检测效果较好;2Gy组小鼠移植后DC数〈10％,随后以不同水平的微嵌舍体存在直至消失,则宜选用realtime—PCR法检测。结论：流式细胞术检测供体大嵌合准确性高,但当DC数〈1％时灵敏度差;realtime—PCR法的灵敏度可检测出微嵌合体,但在检测大嵌合体时精确性差。两种方法互补运用则灵敏度高,精确性强。因此可作为小鼠移植与过继免疫治疗模型中定量检测DC的最佳方法。     

多供体造血干细胞移植术后的嵌合率定量检测

本研究旨在建立检测多供体造血干细胞移植术后供体细胞嵌合率(DD-CHM%)的计算模型并简化计算方法。以接受异基因造血干细胞移植的血液系统疾病患者为研究对象,采用STR-PCR结合毛细管电泳的方法,检测移植术后供体细胞嵌合率。结果表明:在混合嵌合状态下,同一个体来源的等位基因的双峰面积和高度是近似的,可以互相替代;对构建的计算模型中各等位基因的峰面积进行赋值,得到的嵌合率准确值和近似值在可接受的计量系统自身误差范围内(5%-20%)是基本没有差异的。结论:在混合嵌合状态下,来自于同一个体的等位基因在STR位点上的非共享峰是可以替代共享峰面积,此设想可以用作于计算多供体造血干细胞移植术后嵌合率的检测;在计算位点选择上,受体位点的选择比供体位点选择更为重要,能更加有效的简化计算步骤,并能更准确的得到供体细胞嵌合率的结果。     

自身红细胞回输在矫形术中的应用

自身输血包括术前储血、术中血液稀释、术中出血回收等［１］。对于矫形术，回收术中流出的血液进行自身回输较术前贮血和术中稀释更为方便。笔者用细胞回收机对２０名矫形术病人手术野废血回收后自身输血，并与２０名输同种异体血的矫形术病人作对照，观察比较了两组病例...     

自体血回输在外科手术中的应用

目的探讨外科手术中自体血液回输的安全性及效果。方法收集分析2008年至2012年期间外科手术病例362例,其中骨科手术47例,脾破裂254例,肝破裂61例。使用京精3000p型自体血液回收机对患者手术创面或体腔内的血液通过回收抗凝、离心、清洗、净化处理,形成浓缩红细胞,在术中或术后回输给患者。记录术中回收的原血量和经血液回收机处理的血量。观察回输前后的血常规、电解质、凝血功能各项指标的变化,并观察有无不良反应。结果全组病例共回收原血1268896ml,经清洗后回收浓缩红细胞429332ml,平均回输1186ml。患者回输后红细胞、血红蛋白、红细胞比容、血小板、自细胞、凝血酶原时间、活化部分凝血酶原时间、纤维蛋白原、电解质（钾、钠、氯）与回输前比较差异均无统计学差异（P均〉0．05）。均未出现溶血、细菌感染、凝血功能异常等不良反应。结论自体血液回收不仅能节约血源、缓解血荒,还能降低异体输血导致的发热、过敏和溶血等不良反应的发生率。其最突出的优点是能即刻为患者提供与之完全相容的同型新鲜血液,是失血性休克及重大手术患者的重要血液来源。     

自体血回输在肝移植手术中的应用体会

笔介绍在３例肝移植手术中自体血回输的方法,强调自体血回输在肝移植手术中应用的重要性和必要性。在３例肝移植手术的血液回输过程中,体会到自体血回输突出的优点是：安全,无异体佃血引起的血清污染性疾病;并发症少,血液经离心后杂质完全清除,洗涤后能１００％回输而无输血反应;有效解决血清短缺,并能及时回输,迅速扩容,纠正休克,自体血红细胞中２,３－二磷酸甘油值较高,携带氧能力和活性较好。     

输血管在腹水浓缩回输术中的应用

肝硬化大量腹水病人经内科治疗无效或腹水过多影响呼吸、饮食时 ,须进行腹水超滤浓缩腹膜腔回输术。肝硬化主要为漏出液 ,合并腹腔感染时会合并有漏出液 ,其中含有大量的纤维蛋白 ,在进行腹水超滤回输术过程中 ,纤维蛋白常常把静脉管路中的滤网堵塞 ,经用注射器负压抽吸及加肝素等方法 ,治疗仍不能继续进行。从 2 0 0 1年开始 ,我们人工肝室利用输血管连接腹腔穿刺针的方法进行治疗取得了满意效果 ,现介绍如下。1　使用方法进行腹水超滤浓缩回输术引起静脉壶堵塞时 ,以往的经验是更换一套静脉管路的方法 ,而静脉管路我们是使用没有滤网的动…     

自体血液回输技术在外科手术中的应用

自体血液回输就是以血液回收机收集病人手术中流失的血液 ,并用高科技手段对血液进行分离、清洗和净化 ,再将血液回输给病人本人。借助自体血液回输 ,病人可能不须使用或减少使用异体血 ,从而节省了库血 ,并且避免了输异体血可能给病人造成的危害。我科于 1998年 9月开始使用国产自体 -2 0 0 0型血液回收机 ,至 2 0 0 0年 5月 ,手术中应用自体血液回输 2 0 2例 ,效果良好 ,现将应用体会报告如下。1　临床资料1 1　一般资料　 2 0 2例中 ,男 10 3例 ,女 99例 ;年龄9～ 71岁 ,平均 4 7岁 ;手术种类 (表 1)。表 1　应用自体血液回输的手术种类…     

自体血液回输在血管外科手术中的应用

目的观察自体血液回输在血管外科手术中的应用效果。方法2003年2月~2006年6月在24例血管外科手术中使用自体血液回输,记录术野出血量及回输血液量。结果24例血管外科手术平均每例回收术野出血(2245±358)m l(600~4700m l),经处理后回输浓缩红细胞平均每例(760±310)m l(410~1920m l)。全组病人术后恢复顺利,无并发症。结论术中自体血液回输能有效减少血管外科手术中血液的丢失,维持有效循环,为术者彻底行血管外科手术创造条件。     

自体血回输在妇科急腹症中的应用

2000年10月-2006年2月，对因妇科急腹症失血性休克患者采用自体血回输进行抢救，报告如下。     

自体血回输在颅脑手术中的应用研究

自1999年5月,采用“自体-2000型血液回收机”．用于颅脑手术85例,均将术中出血通过吸引罐回收,大量生理盐水冲洗后,再分离、净化处理后回输给患者,共计回收血液44085ml。回收血RBC、HGB及Hct与患者血相比无显著差异,血气及电解质分析证实,回收血PO2明显高于患者静脉血和库血,自体血优于异体血。因此,自体血在颅脑外科应用效果较好．既解决血源紧张,又避免疾病传播,特别是用于颅内动脉瘤夹闭与切除术时出现破裂,可快速将患者血液回输．提高抢救成功率,保证手术顺利进行。     

非清髓造血干细胞移植后致敏供者淋巴细胞输注对嵌合状态及GVHD影响的实验研究

本研究目的是探讨经受者皮肤致敏后的异基因供者淋巴细胞输注(DLI)是否能在促进形成完全供者嵌合(CC)的同时减轻移植物抗宿主病(GVHD)。以C57BL/6小鼠(H-2b,B6)为受者,于第0天接受60Coγ线全身照射(TBI),总剂量为5.5Gy,照射当天移植经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的BALB/c小鼠(H-2d,BA)外周血干细胞(2×107个),移植后第2天腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,并分别于移植后第28天输注致敏/未致敏的供者淋巴细胞2×106。结果显示,致敏后DLI的受鼠(黑色)无1例出现GVHD,60天时转变为完全供者嵌合,表型明显呈现为供鼠(白色)特征,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值在DLI后早期下降,半月后有所升高,但仍低于正常水平;未致敏的DLI受鼠出现不同程度的GVHD,嵌合率稍有上升,仍表现为混合嵌合体(MC),CD4+/CD8+比值在DLI后早期升高,后期降至正常水平。结论:经受者皮肤致敏后的DLI在诱导CC的同时降低GVHD发病率,CD4+/CD8+比值与GVHD发病率间具有良好的相关性。     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

异基因反应性NK细胞在供者淋巴细胞输注治疗单倍体相合造血干细胞移植后肺癌复发中的作用研究

本研究旨在探讨预处理中并基因反应性NK细胞（allo—reactive NK cells,Allo—NK）在供者淋巴细胞输注（DLI）治疗单倍体相合造血干细胞移植后肺癌复发中的作用。采用免疫磁珠富集F1供鼠（H-2^d/b）脾脏allo—NK,流式细胞术和LDH法检测其异体反应性。建立小鼠单倍体相合造血干细胞移植后肺癌复发模型,采用放射性核素标记法追踪DLI的体内分布。比较不同处理组小鼠的肿瘤大小、淋巴细胞浸润程度,采用RayBio小鼠细胞因子抗体芯片检测血清中22种细胞因子的变化。结果表明：在移植后24—48小时,allo—NK组的回输供者淋巴细胞在受者肺脏、脾脏、肾脏中明显蓄积,浓度最高,时间最长。化疗＋DLI组与化疗＋PBS组的肿瘤体积相比无明显区别,但allo．NK＋DLI组的肿瘤体积显著小于化疗＋DLI组（P〈0．05）和allo—NK＋PBS组（P〈0．01）组,且镜下可观察到肿瘤局部较多的淋巴细胞浸润。allo—NK＋DLI组中MCP-1、IL-17、IL—12和MCP-5较对照组分别升高1．56、1．36、1.20、1．17倍;而IL-10降低42．8％。结论：allo-NK可以延长DLI在宿主体内停留时间,促进炎性因子和Th1类细胞因子分泌,抑制肿瘤生长,提高DLI治疗移植后肺癌复发的疗效。     

非清髓性单倍体骨髓移植后输注供体免疫细胞治疗白血病的研究

本研究在小鼠非清髓性单倍体骨髓移植模型上,观察移植后早期输注供体免疫细胞对促进植入及改善疗效的作用。以CB6F1雌性小鼠为受鼠,C57BL/6雄性小鼠为供鼠,移植前4 d经尾静脉注射小鼠红白血病细胞1×106个/只,移植前2 d和1 d分别通过腹腔注射阿糖胞苷0.015 g/只,移植前1d予450 cGy全身照射（TBI）,移植当天给予供鼠骨髓及脾细胞混合物6×107个/只,移植后15 d输注供体免疫淋巴细胞6×107个/只,移植后定期监测受鼠外周血供鼠CD3＋细胞嵌合状态和供鼠性别决定基因（SRY）,观察小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）、疾病复发及生存情况。结果表明：经尾静脉注射小鼠红白血病细胞1×106个/只,不予治疗,小鼠平均生存期为15±1 d;混合骨髓移植组移植后供者细胞获得植入,SRY基因在移植后30和60 d时检测PCR结果均阳性,移植后14、30、60 d外周血供鼠CD3＋细胞嵌合率分别为（17.95±12.03）%、（37.34±2.78）%,（47.06±6.1）%;DLI组移植后30、45、60 d嵌合率为（69.78±12.62）%、（75±15.97）%、（83.41±16.07）%;小鼠移植后平均生存期分别为66.66±1.47 d、78.2±7.82 d。结论：移植前高肿瘤负荷影响供体细胞植入及预后,移植后早期行供体免疫淋巴细胞输注可以进一步改善治疗效果,延长生存期。     

嵌合体监测与供者淋巴细胞输注在地中海贫血患者移植后排斥风险中的作用

造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）治疗重型β-地中海贫血的主要障碍之一是移植后排斥反应（graft rejection,GR）,混合性嵌合体中供者来源细胞比例持续下降,最终导致移植失败.移植后连续性嵌合体的监测能够早期发现不稳定混合嵌合体和排斥反应,为供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusions,DLI）提供依据;应用渐增供者淋巴细胞数输注对早期排斥反应进行干预,可以使嵌合体趋于稳定.本文就重型β-地中海贫血患者HSCT后嵌合体监测与供者淋巴细胞输注的研究进展作一综述.     

地西他滨联合改良CAG及单倍体相合外周血淋巴细胞回输治疗老年高危恶性血液病

本研究旨在观察地西他滨联合改良CAG及单倍体相合外周血淋巴细胞回输免疫治疗新方案,作为初治老年高危骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）的诱导缓解方案的初步疗效及其不良反应。对2012年4月至2012年7月在本院血液科应用地西他滨联合改良CAG及HLA半相合外周血淋巴细胞回输免疫治疗新方案治疗的5例老年高危MDS和AML患者进行前瞻性研究,观察完全缓解率及副反应。结果表明：5例初治老年患者治疗总有效率100%,4例达到完全缓解,1例患者达到部分缓解。既往无MDS病史患者,中性粒细胞数恢复至0.5×109/L的中位时间为15 d,血小板数恢复至20×109/L的中位时间为16 d。主要副作用为IV度骨髓抑制,全部患者治疗中无新发肺部感染等严重并发症。结论：地西他滨联合改良CAG及外周血淋巴细胞回输免疫治疗新方案,治疗老年MDS和AML患者安全有效,值得进一步研究。     

Donor lymphocyte infusion in myeloid disorders

A number of modalities including both pharmaceutical and cell-based treatments have long been tested and developed to prevent and treat relapses after allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT). The ability of donor T cells to recognize antigenic structures on leukemic cell surfaces and destroy them is a well-known fact. Based on this fact, the idea of using donor T cells to contribute to the development of adoptive immunotherapy has emerged. Donor lymphocytes are easy to obtain and donor lymphocyte infusions (DLI) have a simple rational while this treatment modality is an effective example of cellular therapy. The group of chronic myeloid leukemia patients who are more likely to benefit from DLI include: a) patients in the chronic phase of hematologic relapse and b) patients with molecular/cytogenetic relapse. DLI appear to be an appropriate treatment option to be used in combination with conventional chemotherapy or hypomethylating agents in the treatment of post-allo-HSCT relapse for acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome, if:) the burden of tumor is low b) the relapse is at a molecular level rather than an overt hematologic relapse c) the patient has favorable cytogenetic characteristics d) time interval between transplantation and relapse is relatively longer (>5 months) e) response could be obtained after salvage therapies. In the event that minimal residual disease (MRD) or increasing mixed chimerism is detected, prompt administration of DLI for prophylactic purposes without waiting for a manifest relapse, was found to be effective in inducing a full donor chimerism and overcoming MRD and eventually preventing a manifest relapse.     

基于免疫磁珠分选的调节性T细胞亚群嵌合性定量分析

为了探讨免疫分选偶联短串重复序列（STR）方法用于调节性T细胞（Treg）嵌合性定量监测的可行性,以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以单个核细胞为起点,以免疫磁珠阴性和阳性选择法获取CD4＋CD25＋Treg细胞,分选后的Treg细胞再进行16位点的STR长度多态性分析。结果显示,从分选后的Treg细胞提取的DNA量能满足STR检测要求,当嵌合体中受体比例≥10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照STR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例≤1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。结论：建立了基于免疫分选的Treg细胞嵌合性定量分析方法,对造血嵌合体的检出灵敏度和准确性在1%-10%,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。     

适合移植后嵌合物定量分析的信息STR位点谱的建立及其应用

本研究选取8个STR位点作为嵌合物定量分析的信息STR位点谱,评估其作为异基因造血干细胞移植（HSCT）后移植物嵌合状态的定量监控指标的作用。采集15对移植供受者血样,提取DNA,分别合成标记D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481、D22S689的引物,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测这些位点的扩增片段．筛选得到理想的信息位点;制备梯度供者／受者DNA混合品和移植后不同日期采集的标本,进行信息位点的检测;获取峰高或峰面积进行移植嵌舍率的计算。结果显示,根据梯度混合DNA的结果获得标准曲线,计算得到的嵌合率和配制浓度中的嵌合比例基本一致;用峰高和峰面积同时计算,两者基本一致;成功获得了15例移植后病人的嵌舍状态变化数据,并帮助诊断了1例复发病人。结论：本研究建立的信息STR位点谱及检测方法,可以较准确地定量监控嵌合状态,成功用于临床干细胞移植工作,与商品化试剂相比,更便宜,在使用上更灵活。