嵌合体监测在非清髓异基因造血干细胞移植后干预治疗中的应用

非清髓异基因造血干细胞移植包括非清髓性预处理和移植后的临床干预治疗．而以后者更为重要。通过免疫抑制强度的调整、供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion,DLI）及二次移植等手段,强化移植物抗自血病（graft versus leukemia effect,GVL）效应,增加供体细胞植入,预防白血病复发,使部分移植后发生移植排斥和白血病复发的患者得到再次植入和完全缓解。国际骨髓移植登记处（IBMTR）主张干预性治疗必须在嵌合状态动态监测结果的指导下进行。我们对9例非清髓异基因造血干细胞移植后处于混合嵌合状态或疾病进展期．出现供体细胞（donor cell。DC）嵌合率下降,早期移植排斥和复发的患者在术后不同时间段监测嵌合体,并在此指导下给予临床干预治疗,取得较好疗效,现报道如下。     

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的　建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列 (STR PCR)结合毛细管电泳 ,定量检测供体细胞 (DC)嵌合率的方法 ,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后转归的预警作用。方法　采集 31例接受骨髓移植 (BMT)或非清髓外周血干细胞移植 (NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓。DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后 ,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳 ,确定基因位点及峰面积 ,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果　 31例患者中 15例 (48.4 % )为性别相合移植 ,只能通过STR PCR进行嵌合体的定量分析 ;性别不合移植患者用STR PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致 ;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有 6 .7(2～ 10 )个 ,所有患者均在移植后 7天 ( 7天 )出现供体来源的细胞 ,BMT组 7天、 14天和 1个月DC中位数均明显低于NST组 ,而在移植中后期无显著性差异。 2 1天时BMT和NST患者均达稳定嵌合 ,DC在 92 %以上 ;中位随访 17(3.5～ 2 9.0 )个月 ,2 6例患者DC≥90 % ,均获得持久植入 ,至今均为无白血病生存。另有 5例患者出现不稳定混合嵌合 (MC)状态 (DC为2 7.3%～ 6 2 .7% ) ,其中 4例复发 ,1例出现移植物被排斥。上述 5例患者均     

异基因造血干细胞移植后细胞嵌合状态动态监测的临床意义

目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后各系细胞嵌合状态与移植物植入、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物被排斥和疾病复发的关系.方法 对65例患者进行allo-HSCT,在移植后定期采集所有患者的外周血和骨髓.用流式细胞术分选了65例患者的CD3+T淋巴细胞,52例分选了CD3-CD56+CD16+NK细胞,32例分选了CD15+粒细胞,20例分选了CD19+B淋巴细胞.进行PCR扩增短串联重复序列检测各系细胞嵌合状态.结果 移植后NK细胞早期植入比例(55.5%)最高,T细胞最晚(+21 d)达到完全供者嵌合状态.+7 d T淋巴细胞供者嵌合比例(DC)≥70%和+14 d T淋巴细胞DC≥95%属aGVHD发生的高危患者.除急性淋巴细胞白血病外,出现移植物被排斥的分子生物学征象者和疾病复发者,都以T淋巴细胞供者嵌合状态下降为主.在过继免疫治疗中,动态检测嵌合状态可以判断疗效和指导进一步的治疗.结论 allo-HSCT后T淋巴细胞嵌合状态动态检测可以早期预测发生aGVHD的高危患者、判断移植物植入、发现移植物被排斥和疾病复发并指导免疫调节治疗的时机和疗效.     

STR-PCR联合RT-PCR技术在慢性髓细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后微小残留病变检测中的应用

为了探究STR PCR联合bcr/abl融合基因转录本RT PCR定性检测技术对慢性髓细胞白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后复发的预测价值 ,对接受allo HSCT的 2 4例CML患者进行微小残留病变(MRD)的动态检测 ,对供体细胞嵌合率 (DC)采用复合扩增荧光标记STR PCR结合毛细管电泳方法进行定量检测 ,对bcr/abl融合基因转录本采用巢式RT PCR方法检测。结果显示 :移植后长期处于完全供体细胞嵌合状态(FDC)即DC≥ 95 %的患者bcr/abl均转为阴性 ,MRD消失 ;稳定混合嵌合状态 (MC)即 90 %≤DC <95 % ,并且bcr/abl阴性的患者 ,也可达到分子水平的缓解并长期生存 ;但是bcr/abl的阳性结果并不总是与复发相关 ,只有当DC进行性下降 (DC <90 % ) ,而同时bcr/abl阳性时 ,才有复发或植入失败的可能 ,对该类患者应尽早实施临床干预性治疗。本研究中有 5例患者出现DC下降和MRD阳性 ,其中 3例为分子水平复发 ,1例为细胞遗传学水平复发 ,1例为植入失败。结论 :STR PCR在敏感范围内 ,其结果与RT PCR的结果符合率高 ,两种技术的结合是一种检测MRD高度敏感的手段 ,可检出allo HSCT后发生分子生物学或细胞遗传学复发的高危患者。     

同种异基因造血干细胞移植后基于血细胞嵌合状态的个体化免疫治疗

目的:研究同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后血细胞嵌合率变化与复发的关系;观察根据血细胞嵌合率变化给予个体化免疫抑制剂治疗和供者淋巴细胞输注(DLI)的疗效。方法:106例供者细胞顺利植入的allo-HSCT患者,采用聚合酶链反应(PCR)扩增短串联重复序列的方法,动态检测移植后T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞的嵌合率。根据血细胞嵌合率的变化调整免疫抑制剂剂量和DLI的使用。结果:6例患者在移植后2个月,供者T细胞嵌合状态一直为混合嵌合(MC),将免疫抑制剂减量后均达到完全供者嵌合(FDC)。12例患者在移植后1～5个月,发生供者T细胞嵌合率下降,予免疫抑制剂减量后转为FDC。24例患者血液学复发或髓外复发(进展),有6例在复发前共发生10例次血细胞嵌合率下降,经免疫抑制剂减量或停药后一度回升至FDC,但最终血液学或髓外复发。12例患者在复发或疾病进展后停用免疫抑制剂,共给予DLI23例次,其中8例在DLI前或后给予化疗,最终5例再次达到完全缓解,其余患者最终均因疾病复发死亡。Ⅱ度及Ⅱ度以上急性移植物抗宿主病(GVHD)发生率为28.3%。慢性GVHD发生率为55.7%。中位随访期为17(1.5～90.0)个月,无病生存65例,死亡41例。67例标危患者预期3年生存率为59.0%;39例高危患者预期3年生存率为44.7%。结论:T淋巴细胞、NK细胞和B淋巴细胞的嵌合状态可作为血液恶性肿瘤复发的预测指标;基于血细胞嵌合率的个体化免疫治疗可以推迟甚至避免临床复发,且不增加急性GVHD的发生。     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

异基因嵌合体延长皮肤移植物生存

目的探讨小檗胺联合供体脾细胞输注诱导的微嵌合状态对皮肤移植物生存的影响。方法选择BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)和615(H-2k)小鼠分别作为受体、供体和第三供体,采用不同的方式处理受体动物(小檗胺、供体脾细胞悬液输注、小檗胺联合供体脾细胞输注)诱导微嵌合状态,同时移植皮肤。观察皮肤移植物存活时间,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测受体脾脏细胞因子(IL-2、IL-4)。流式细胞仪检测受体脾脏的微嵌合状态。结果小檗胺联合供体脾细胞输注可诱导微嵌合状态而形成免疫耐受,明显延长同种皮肤移植物的平均生存时间[MST=(26.5±7.0)d],排斥第三供体。实验组IL-2和IL-4均低于对照组与第三供体组。单纯小檗胺或供体脾细胞输注均可诱导微嵌合状态,也可延长皮肤移植物的生存时间[MST分别为(16.0±3.5)d和(12.7±2.1)d],但微嵌合状态的程度和延长皮肤移植物生存的作用不及小檗胺联合供体脾细胞输注(P<0.01)。微嵌合状态的程度与延长移植物生存时间无相关性。结论小檗胺联合供体脾细胞输注可诱导微嵌合状态产生免疫耐受。     

供体淋巴细胞输注治疗异基因干细胞移植后白血病复发的现状和展望

异基因造血干细胞移植(Allo-SCT)后白血病复发是困扰Allo-SCT的主要障碍之一。复发后治疗困难,传统治疗措施疗效差、毒性大。临床研究显示采用原移植供体的淋巴细胞输注(DLI)可使Allo-SCT后白血病复发患者获再次缓解,尤以Allo-SCT后慢性粒细胞白血病复发早期患者疗效显著。DLI治疗主要相关毒性是移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血障碍。Allo-SCT后白血病复发的DLI治疗的研究进展主要集中红提高疗效,降低相关毒性发生率及严重性方面。DLI治疗宜在复发早期进行,而细胞剂量目前意见不一。随着研究的深入,Allo-SCT后白血病复发的DLI治疗有希望成为解决Allo-SCT后复发治疗难题的新策略。     

白血病异基因造血干细胞移植复发后的过继免疫治疗

异基因造血干细胞移植后白血病复发是导致移植失败的首要原因。如何防治复发是移植领域研究的重点和难点。供体淋巴细胞输注(DLI)是移植后复发防治中首选的过继免疫治疗手段。本文就DLI效应的可能机制、DLI治疗时机和策略、DLI疗效的影响因素、DLI剂量与方式、常见并发症以及优化的DLI策略等进行综述。     

嵌合体监测与供者淋巴细胞输注在地中海贫血患者移植后排斥风险中的作用

造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）治疗重型β-地中海贫血的主要障碍之一是移植后排斥反应（graft rejection,GR）,混合性嵌合体中供者来源细胞比例持续下降,最终导致移植失败.移植后连续性嵌合体的监测能够早期发现不稳定混合嵌合体和排斥反应,为供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusions,DLI）提供依据;应用渐增供者淋巴细胞数输注对早期排斥反应进行干预,可以使嵌合体趋于稳定.本文就重型β-地中海贫血患者HSCT后嵌合体监测与供者淋巴细胞输注的研究进展作一综述.     

STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测

本研究采用STRPCR检测方法，观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况。提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA，PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，分析其植入情况。结果表明：15例患者均有不同程度植入，其中完全供者植入10例，供受者混合嵌合体5例。持续缓解10例，死亡4例，1例复发但仍存活。混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发。Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性。结论：STRPCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法，混合嵌合状态对白血病复发有预警作用。嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用。     

Donor lymphocyte infusion in myeloid disorders

A number of modalities including both pharmaceutical and cell-based treatments have long been tested and developed to prevent and treat relapses after allogeneic stem cell transplantation (allo-HSCT). The ability of donor T cells to recognize antigenic structures on leukemic cell surfaces and destroy them is a well-known fact. Based on this fact, the idea of using donor T cells to contribute to the development of adoptive immunotherapy has emerged. Donor lymphocytes are easy to obtain and donor lymphocyte infusions (DLI) have a simple rational while this treatment modality is an effective example of cellular therapy. The group of chronic myeloid leukemia patients who are more likely to benefit from DLI include: a) patients in the chronic phase of hematologic relapse and b) patients with molecular/cytogenetic relapse. DLI appear to be an appropriate treatment option to be used in combination with conventional chemotherapy or hypomethylating agents in the treatment of post-allo-HSCT relapse for acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome, if:) the burden of tumor is low b) the relapse is at a molecular level rather than an overt hematologic relapse c) the patient has favorable cytogenetic characteristics d) time interval between transplantation and relapse is relatively longer (>5 months) e) response could be obtained after salvage therapies. In the event that minimal residual disease (MRD) or increasing mixed chimerism is detected, prompt administration of DLI for prophylactic purposes without waiting for a manifest relapse, was found to be effective in inducing a full donor chimerism and overcoming MRD and eventually preventing a manifest relapse.     

STR-PCR和FISH在监测异性别异基因造血干细胞移植后嵌合状态中意义的比较

本研究比较短串联重复序列PCR（STR—PCR）和荧光原位杂交（FISH）两种方法在异基因造血干细胞移植后血细胞嵌合状态监测中的意义。对38例接受异性别异基因造血干细胞移植的患者,采用STR—PCR和FISH定量测定移植后14、28天和3个月的骨髓或外周血细胞嵌合状态。结果表明,14天时STR—PCR和FISH同时检测的30例中分别有14例和8例达到完全嵌合（CC,P〉0．05）。28天时两者同时检测的31例中分别有26例和15例达到CC（P〈0．01）。3个月时两种方法共同监测的24例中分别有22例和17例达到CC（P〉0．05）。连续监测3个月以上的28例患者中14倒发生移植物被排斥或复发,其中9例由FISH首先检出（P〈0．05）。结论：FISH检测比STR—PCR更为准确地反映移植早期造血细胞嵌合状态,有助于监测移植物被排斥和疾病复发。     

非清髓异基因造血干细胞移植患者早期造血细胞嵌合体检测及其临床意义

目的　研究非清髓异基因造血干细胞移植 (NAST)早期造血细胞嵌合体变化规律 ,探讨分子植入 (ME)与造血恢复、移植排斥的关系。方法　应用短串联重复序列 (STR) PCR技术检测 6例血液病患者NAST后外周血及骨髓中造血细胞嵌合体。结果　NAST后 5例早期移植成功的病例其外周血造血细胞嵌合体变化特点为 :移植后 1天 ( 1天 )供者造血细胞嵌合比例为 13%～ 6 0 % , 7天嵌合比例均 >5 0 % , 14天达到完全供者造血嵌合 (FDC) , 2 1～ 2 8天嵌合比例稳定在 80 %～ 10 0 %。这 5例ME时间平均为 6天 ,较造血恢复时间提前 5d(P >0 .0 5 )。而 1例在 7天嵌合比例 <5 0 % , 14天为完全受者细胞 ,但其在 14天亦恢复自身造血。结论　NAST早期造血细胞嵌合体检测及确定ME对判断植入、预测移植排斥具有重要意义。NAST后如 7天供者造血细胞嵌合比例 <5 0 %、 14天仍未达到ME ,预示着发生移植排斥的可能性较大