心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

重组人白介素21的原核表达与体外活性研究的优化

为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21(DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色谱柱纯化后,尿素缓冲液梯度透析复性,最终溶于PBS缓冲液;双抗体夹心法ELISA、Western blotting检测复性蛋白的生物活性;细胞增殖抑制试验(MTT法)研究rhIL-21对Jurkat细胞株和HuT102细胞株的作用。实验成功建立了rhIL-21表达纯化与活性评价体系,为进一步研究IL-21的促免疫性疾病发展和抗肿瘤活性奠定了基础。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定

目的构建高表达的抗CD5单链抗体(scFv anti-CD5)工程菌,为开展以抗CD5单链抗体为构件的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。方法从Genbank中获得抗CD5单克隆抗体H65的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因序列,用连接肽的编码序列连接,用重叠PCR技术获得目的基因,酶切后插入pET22b(+)构成重组质粒。测序正确的重组质粒转入E.coliBL21(DE3)诱导表达,产物经Ni-NTA柱纯化后复性,流式细胞术和Western blot-ting检测活性。结果获得序列正确的重组质粒,工程菌表达量高,产物复性后具有识别CD5抗原的活性。结论成功构建了高表达scFv anti-CD5的工程菌,为scFv anti-CD5的应用奠定了基础。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

重组人白细胞介素21表达条件的探讨

目的探讨重组人白细胞介素21工程菌诱导表达的最佳条件。方法用摇瓶发酵的方法探索不同诱导条件(诱导温度、诱导时间、接种量I、PTG浓度等)对目的蛋白质表达的影响。结果该工程菌表达目的蛋白质的最佳温度是42℃;高密度接种更有利于目的蛋白质的表达。结论建立了BL21/pET-30a(+)-IL21工程菌最佳诱导表达条件,为重组人白细胞介素21的制备奠定了基础。     

The differential expression of HSV -1 UL12 gene in E.coil BL21 and E.coli Rosetta

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV -1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a - ULI2,比较重组表达质粒pET32a -UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性.方法 使用PCR的方法扩增出HSV -1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a - UL12,分别转化E.coli BL21和E coli Rosetta菌.经SDS - PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性.结果 重组质粒pET32a - UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高.结论 成功构建了表达出了具有较高活性的HSV -1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV -1药物奠定了基础.     

海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定

本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒UL12基因在大肠杆菌BL21和Rosetta菌中的差异表达

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)的UL12基因原核重组表达质粒pET32a-UL12,比较重组表达质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coli Rosetta表达产量与生物学活性。方法使用PCR的方法扩增出HSV-1的UL12基因,克隆至原核表达质粒pET32a(+),构建出重组质粒pET32a-UL12,分别转化E.coli BL21和E.coli Rosetta菌。经SDS-PAGE鉴定分析目的蛋白的表达差异,并比较在两种菌中目的蛋白的活性。结果重组质粒pET32a-UL12在E.coli BL21和E.coliRosetta的包涵体中均表达出了碱性核酸酶融合蛋白,E.coli Rosetta中表达的碱性核酸酶融合蛋白表达量较大,而E.coliBL21中表达的碱性核酸酶活性更高。结论成功构建了表达出了具有较高活性的HSV-1碱性核酸酶融合蛋白,为进一步研究抗HSV-1药物奠定了基础。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

犬尿氨酸-3-单加氧酶SibC的体外蛋白表达纯化与生化反应

目的通过体外基因合成西比罗霉素(sibiromycin)生物合成途径中推测但未验证功能的犬尿氨酸-3-单加氧酶编码基因sibC(GenBank:FJ768674.1:1380-2810),研究该犬尿氨酸-3-单加氧酶SibC的体外生化功能,为解析放线菌素D中相关结构单元的生物合成途径提供参考。方法通过生物信息学分析体外全合成基因sibC的序列并克隆至表达载体,将重组质粒pET28a-sibC转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化SibC,以犬尿氨酸(kynurenine,kyn,1)为底物进行SibC的体外酶活性测试,利用高效液相色谱(HPLC)对酶反应产物进行分析。结果PCR验证证明表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a/sibC构建成功,SibC蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法纯化获得SibC蛋白,纯化的SibC能够催化犬尿氨酸生成3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine,3-HK,2)。结论体外验证了sibiromycin中SibC的功能为犬尿氨酸-3-羟化酶,为进一步研究犬尿氨酸途径及放线菌素的生物合成奠定了基础。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE

基因caiB和基因caiE分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶，携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白，得到高活性肉碱脱水酶。分别构建这两个基因的表达质粒pET28caiB和pET22caiE，利用双抗生素筛选法，获得能稳定遗传的双质粒转化子。经IPTG诱导，两个基因共表达，表达量分别占菌体总蛋白的39％和20％，共转化菌的酶活力比pET28caiB单转化菌提高了2．3倍，并由此建立了不相容质粒共表达外源基因的新方法。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

蝎毒活性肽BmK AS的基因克隆与表达

目的克隆东亚钳蝎活性肽BmKAS的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法利用PCR技术从蝎尾cDNA pool中扩增BmKAS基因,通过基因工程方法构建表达载体pET28a-BmKAS,在E.coli中进行表达,表达产物为包含体。采用分步稀释复性法对表达产物进行体外变复性。结果BmKAS以包含体的形式得到表达,表达量的质量约占菌体总蛋白质量的31%。表达产物复性后,通过离子交换柱层析进一步纯化,达到了电泳纯,收率为1.6 mg.L-1。结论首次对具有多种药理活性的蝎毒活性肽BmKAS进行了表达,并对表达产物进行体外变复性研究,获得了毫克级的收率,满足了深入研究需要。     

重组蛋白A在大肠杆菌中的分泌表达及活性测定

利用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白A,根据大肠杆菌密码子偏好性对金黄色葡萄球菌蛋白A的基因序列进行密码子优化,在N端加入L-门冬酰胺酶(L-AsPsII)信号肽简并基因序列使其分泌表达,将全合成的蛋白A基因片段插入到pET-28a载体中,转化入BL21(DE3)。乳糖诱导使其表达,其中80%以上目的蛋白位于胞外,表达量达到375 mg/L,剩余目的蛋白位于周质。将胞外目的蛋白超滤浓缩,通过DEAE阴离子交换剂,一步纯化后得到的蛋白,在SDS-PAGE上显示为约32 k的单一条带,纯度达95%以上。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白A活性较高,能与小鼠、兔及羊IgG抗体高效结合,且沸水煮10 min后仍能保持同IgG结合的活性。