焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

焦磷酸测序法在败血症常见病原体检测中的应用

目的将焦磷酸测序技术应用于败血症常见病原体的检测鉴定。方法根据细菌16S rRNA序列的特点,设计焦磷酸测序用的PCR扩增引物和测序引物,提取败血症常见病原体的基因组DNA,进行焦磷酸测序,分析获得的序列,进行比对,对病原体种类作出判断。结果经焦磷酸测序可以获取有效长度28 bp的序列,使用该测序序列可以有效区分化脓性链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、脑膜炎双球菌、沙门氏菌,但不能区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。结论应用焦磷酸测序可以较有效地对败血症常见病原体的种类实现种属水平的区分。     

焦磷酸测序技术检测63例晚期NSCLC患者血浆KRAS基因突变

目的探讨应用焦磷酸测序技术检测血浆KRAS基因突变的实用性,了解晚期非小细胞肺癌(NSCLC)血浆KRAS基因突变率和突变特征。方法收集63例晚期NSCLC患者的外周血标本,分离血浆并提取DNA,采用巢式PCR结合焦磷酸测序分析KRAS基因12和13号密码子突变。结果在63例晚期NSCLC患者中,3例存在血浆KRAS基因突变(4.76%),突变率较低,与亚裔组织KRAS突变率一致,低于西方人KRAS突变率,其突变类型均为单碱基替换突变。其中2例为12密码子突变,1例为13密码子突变。统计学分析未发现血浆KRAS突变与性别、吸烟史、年龄、病理类型、肿瘤分期、体力状况(PS)评分存在相关性。结论焦磷酸测序技术操作简便,可以快速、高通量地进行外周血循环KRAS基因突变检测,可广泛用于筛选对酪氨酸激酶抑制剂耐药的NSCLC患者,更有利于指导患者的个体化分子靶向治疗。     

应用焦磷酸测序法检测MEG3基因在急性髓系白血病中的甲基化状态

目的检测MEG3基因启动子区在急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中的甲基化状态,并探讨其在AML中的临床意义。方法以54例初诊AML患者骨髓细胞标本为研究对象,11例缺铁性贫血患者骨髓细胞标本、10例健康人外周血标本为对照。常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理。然后用PCR扩增目标序列,采用焦磷酸测序法检测MEG3基因甲基化状态。结果 (1)MEG3基因的高甲基化状态与AML患者的年龄、性别、白细胞总数、血红蛋白量、血小板计数等指标及临床分型间均未发现显著相关性。(2)AML患者低甲基化5例,高甲基化49例,高甲基化的比例为90.7%(49/54);缺铁性贫血患者对照组低甲基化6例,高甲基化5例,高甲基化的比例为45.5%(5/11);而在正常人对照组低甲基化10例,无高甲基化者,高甲基化的比例为0%;AML患者甲基化状态明显高于另外两组,差异有统计学意义(P<0.05),缺铁性贫血患者对照组与正常人对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MEG3基因启动子区的异常甲基化与急性髓系白血病的发生有关,对诊断、评价AML有一定意义。     

焦磷酸测序技术快速测定肾移植受体人群CYP3A5*3基因多态性方法的建立

目的 建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)肾移植受体CYP3A5*3基因多态性的简单、快速、准确、高通量的检测方法.方法 提取221例肾移植受体和200例健康人外周血基因组DNA,应用PyroMark ID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序,采用Sanger法DNA测序作为标准对照,观察分析焦磷酸测序法的可靠性,并分析肾移植受体人群CYP3A5*3多态性的分布.结果 建立了基于焦磷酸测序技术的CYP3AS*3基因多态性检测新方法,实现了DNA标本的快速、可靠、高通量检测,经重复性检测和Sanger标准法DNA测序可靠性检测,用焦磷酸测序技术检测CYP3A5*3多态性的突变检出率及重复率均达100%.221例肾移植受体CYP3AS*3基因型分布:*1/*1型为23例(10.4%),*1/*3型为89例(40.3%),*3/*3型为109例(49.3%),与正常人群比较等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡.结论 与传统的测序方法相比,焦磷酸测序法能够简单、快速、准确地测定肾移植受体CYP3A5*3基因型,适合临床推广应用.     

噬菌体展示随机肽克隆的一种快速、高通量测序技术

目的:探索应用焦磷酸微测序(Pyrosequencing)技术建立一种针对噬菌体展示随机肽的高通量序列测定方案。方法:环7肽噬菌体展示随机肽库的淘筛后随机挑选10个蓝色噬菌斑作为模板,PCR扩增随机7肽区序列,应用Pyrosequencing技术进行实时测序和分析。结果:应用Pyrosequencing技术对10例样品的随机7肽区进行序列分析,得到一个GXXXHPQ的同源基序(X为任意氨基酸),此基序为链亲合素的结合肽基序,结果与预期相符合。结论:Pyrosequencing技术具有操作简易快速、高通量的优点,必定可以广泛应用于各种随机肽库的筛选测序。     

云贵地区淡水湖中类蛭弧菌多样性分析

目的：对贵州阿哈湖、百花湖及云南滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌进行分类鉴定,了解云贵地区淡水中类蛭弧菌多样性.方法：培养云贵地区3个湖泊中分离的类蛭弧菌,进行16S rRNA基因测序分析,用MEGA 6.0软件以邻接法构建3个湖泊中类蛭弧菌16S rRNA序列的系统发育树,并以最大似然法（PHYLIP3.1软件）加以验证.结果：从阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中分离的类蛭弧菌覆盖率C值为75％,根据类蛭弧菌16S rRNA构建发育树,本研究所得的类蛭弧菌分属3个簇群,γ-Proteobacteria （8.3％）、δ-Proteobacteria（50.0％）及Sphingobacteria（41.7％）;在百花湖中分离得到1株路德维希肠杆菌,分离自贵州阿哈湖的6株菌株与噬菌弧菌属的Bacteriovorax sp.EPA同源性较高,分离于滇池的5株菌株的序列为不可培养细菌序列.结论：云贵地区阿哈湖、百花湖及滇池不同深度湖水中的类蛭弧菌具有较高多样性,推测在云南滇池区域存在着尚未开发的新型类蛭弧菌资源.     

基于16S rRNA基因测序的四妙散加减方治疗痛风性关节炎的作用机制研究

目的 研究四妙散加减方治疗痛风性关节炎患者前后肠道菌群结构和丰度的差异,阐释治疗措施与肠道微生物种群的关联性。方法 将2020年5月-2022年5月符合纳入标准的痛风患者采用四妙散加减方治疗,收集治疗前后的粪便组织样本,采用高通量测序的技术对痛风患者肠道菌群中的16S rRNA V3-V4 区进行基因测序,将得到的结果进一步进行生物信息学的分析,比较各种菌群的群落结构及多样性。结果 共入选15例患者。α多样性方面,Kruskal-Wallis方法结果显示,A治疗前组Shannon指数低于B治疗后组(P<0.05),Observed OTU、Faith"s PD和chao1指数虽然也是降低的但无统计学差异；β多样性方面,主坐标分析显示,第1主成分的贡献度为12.5%,第2主成分的贡献度为8.5%；Permanova分析显示T=1.764,P= 0.005,分组有意义。与治疗前相比,治疗后含有Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Fusobacteri(梭杆菌门)的比例减少,而Actinobacteria(放线菌门)的比例增多。结论 采用四妙散治疗痛风性关节炎患者前后的肠道菌群存在一定的差异性,为四妙散加减方辨证治疗痛风性关节炎的相应机制提供依据,为中医药治疗痛风性关节痛提供全新的思路。     

16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎快速诊断中的应用

目的 评估16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎(SBP)快速诊断中的应用价值.方法 采用16S rRNA基因荧光定量多聚酶链反应检测76例疑似SBP及6例非感染性腹腔积液患者腹水细菌DNA,并与腹水细菌培养结果进行比较.结果 16S rRNA检测疑似SBP患者腹水标本的阳性率为22.4%,明显高于腹水细菌培养的7.9%(P<0.01) .6例非感染性腹腔积液患者的腹水16S rRNA基因荧光定量PCR检测结果和细菌培养结果均为阴性.结论 16S rRNA检测可做为SBP的快速诊断方法,其敏感性优于腹水细菌培养.     

PCR结合DNA测序技术检测急性白血病FLT3与NPM1基因突变及其临床意义

目的 研究成人急性白血病(AL)患者FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)及核仁磷酸蛋白(NPM1)基因突变发生情况及临床意义.方法 采用PCR结合DNA测序技术分析65例初诊急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞中FLT3及NPM1基因突变发生情况.结果 在59例急性髓系白血病(AML)患者中检测到FLT3-ITD突变阳性10例(16.9%),NPM1突变阳性15例(25.4%),其中3例同时存在FLT3-ITD突变及NPM1基因突变;而在6例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中均未检测到FLT3-ITD突变或NPM1基因突变.两种突变均与初诊时中位WBC数、染色体正常核型比例及伴有特异性融合基因患者比例有相关关系(P＜0.05).FLT3-ITD+AML患者初诊时骨髓原始细胞比例高(P＜0.05),单纯NPM1+AML患者初诊时表现为BPC较高(P＜0.05)、免疫表型CD34阳性患者比例低(P＜0.05);FLT3-ITD突变阳性者化疗后有低缓解率趋势.结论 FLT3-ITD突变和NPM1基因突变是AML患者常见的基因突变类型.对初诊时高白细胞计数、血小板计数不低、骨髓原始细胞比例高、CD34阴性表型和正常核型的AML患者检测FLT3-ITD突变和NPM1突变,有利于临床判断预后和指导治疗.     

应用PCR技术快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种

目的 建立快速鉴定结核分枝杆菌复合群菌种的方法.方法 将7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物(Mtbc1-7)进行聚合酶链反应(PCR)扩增,通过对扩增产物的不同系带型进行分析,对已知标准株和96株临床分离株进行菌种鉴定.结果 用3株结核分枝杆菌复合群(MTBC)标准株,9株非分枝杆菌标准株以及27株非结核分枝杆菌的分枝杆菌(MOTT)对7对结核分枝杆菌复合群各菌种特异性引物进行特异性鉴定,结果证明引物Mtbc1能鉴定出分枝杆菌和非分枝杆菌;引物Mtbc2能鉴定出MOTT和MTBC;引物Mtbc3能鉴定出田鼠分枝杆菌;引物Mtbc4能从MTBC中识别出牛分枝杆菌和卡介苗;引物Mtbc5能鉴定出非洲分枝杆菌Ⅱ型和结核分枝杆菌;引物Mtbc6和引物Mtbc4结合能鉴定出卡介苗;引物Mtbc7和引物Mtbc5联合能鉴定出canettii分枝杆菌.96株临床分离株经7对引物扩增,扩增结果显示MOTT 20株,牛分枝杆菌1株,卡介苗1株,canettii分枝杆菌3株,田鼠分枝杆菌3株,非洲分枝杆菌Ⅰ型3株,caprae分枝杆菌1株,结核分枝杆菌或非洲分枝杆菌Ⅱ型64株.结论 应用PCR技术鉴定结核分枝杆菌复合群菌种结果准确可靠,且具有简便和快速等优点,有较大的分子流行病学应用价值.     

利用多重PCR检测3种食源性致病菌

目的旨在建立一种可以同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR方法。方法以金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌invA、志贺氏菌ipaH基因作为靶序列设计3对特异性引物,进行PCR反应得到223bp、302 bp、369 bp扩增片段,经测序证实扩增产物为目的片段。结果采用建立的FTA滤膜结合多重PCR的检测方法同时对这3种食源性致病菌进行检测,灵敏度均达到102 cfu/ml。结论该方法灵敏度高、耗时短,可用于同时检测3种致病菌,为预防控制细菌性食物中毒的暴发流行提供了新的检测方法。     

重组克隆PCR扩增快速筛选方法的建立

目的：建立PCR扩增快速筛选重组克隆的方法。方法：利用载体本身的启动子序列和目的片段的特异性引物作为引物,通过合理搭配,用常规PCR方法扩增待检重组克隆。结果：可以方便地筛选出重组克隆以及顺向和反向重组克隆,与传统的酶切鉴定结果一致。结论：该方法可以快速、准确的筛选重组克隆,并能够确定片段插入的方向和大小。     

微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用

目的 探讨微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用价值。方法 收集138例4—12孕周孕妇的外周血液样品，提取血浆DNA。选取胎儿DNAY染色体上的6个特异性序列SRY1、SRY2、SRY3、DYS1、DYS14和DYZ3基因作为男性胎儿标志物，采用微乳液PCR进行扩增，同时标记荧光，以β-globin基因作为阳性内对照。扩增产物与固定在基因芯片上的探针分子杂交，采用ScanArray 5000扫描仪扫描芯片。检测结果与胎儿出生性别进行比较。结果 最早的检出样品来自孕31d的孕妇，在78份男性胎儿孕育者血样中，有76份样本6个Y染色体特异序列均为阳性；60份女性胎儿孕育者血样中没有一个Y染色体特异序列阳性。微乳液多重PCR基因芯片法对男性胎儿早孕期检测的灵敏度达到97．4％，特异度达到100％。结论 微乳液多重PCR基因芯片法检测孕妇外周血中男性胎儿DNA的方法具有较高的灵敏度和特异度，能够早期鉴定胎儿性别，对性连锁遗传病的筛选具有潜在的应用价值。     

HPLC-TOF/MS快速鉴别相思藤中的化学成分

目的 采用高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)技术对相思藤的化学成分进行快速鉴别。方法 色谱柱：安捷伦Zorbax Eclipse SB-C₁₈ (3.0′100mm,3.5mm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,流速0.4mL.min_-1,柱温25℃,紫外检测波长254nm,进样10mL;飞行时间质谱采用ESI源,正离子模式监测,质量数扫描范围50~2000。结果 共鉴别出相思藤中15个化学成分,其中正离子模式下10个、负离子模式下11个、正负离子均有响应6个。结论 采用HPLC-TOF/MS可以快速鉴别相思藤药材中的化学成分,为相思藤药材的质量控制研究及临床合理应用提供依据。     

多重聚合酶链反应技术快速鉴定鲍曼不动杆菌

目的 建立快速鉴定鲍曼不动杆菌菌株的方法.方法 本研究建立多重PCR实验技术快速鉴定170株醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体以及对照组的其他菌属14株.结果 138株菌的PCR产物扩增出2条条带,为鲍曼不动杆菌,另外32株只扩增出1条条带,为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的其他基因型,对照组的菌株没有扩增出条带.结论 多重PCR技术的建立为快速鉴定鲍曼不动杆菌提供了一个快速而简便的方式.     

实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立

目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10～100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。     

Rapid detection of Shigella and Salmonella in rhesus monkeys by loop-mediated isothermal amplification assay

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detecting diarrhea pathogens (Shigella and Salmonella) in rhesus monkeys and evaluate the application of the LAMP method for detecting bacterial diseases in non-human primate laboratory animals. Materials and Methods A total of 205 fecal samples of rhesus monkeys were detected in this LAMP assay. The specificity and sensitivity of LAMP for Shigella and Salmonella were analyzed, and real-time polymerase chain reaction (REAL-TIME PCR) assay was employed as control. Results The LAMP method established here needed only 45 min to complete the reaction at 63℃. Its detection limit was 10 pg/μL and with a high specificity. The positive rate of Shigella and Salmonella was 1.5% and 6.3%, respectively. Conclusions Here we have established a fast and simple Shigella and Salmonella LAMP detection method that has strong specificity and high sensitivity and is suitable for rapid detection of bacterial disease in macaques. The development of this rapid detection kit is underway, and it will be helpful to the diarrhea detection.     

HPLC-ELSD法测定蒺藜粗皂苷中3种甾体皂苷元

目的 同时测定蒺藜粗皂苷中海柯皂苷元、薯蓣皂苷元和替告皂苷元的量。方法 采用HPLC-ELSD法,色谱柱为Agilent Zorbax SB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为甲醇-水（86∶14）,漂移管温度100 ℃,载气体积流量2.5 L/min。结果 海柯皂苷元、薯蓣皂苷元和替告皂苷元分别在114.1～1 141.0 μg/mL（R²＝0.999 2）,16.88～168.80 μg/mL（R²＝0.999 4）,78.60～786.00 μg/mL（R²＝0.999 3）呈良好线性关系;蒺藜粗皂苷中海柯皂苷元、薯蓣皂苷元和替告皂苷元的平均回收率分别为99.7%（RSD为1.6%）、99.3%（RSD为1.4%）、99.4%（RSD为1.1%）。结论 该方法简便、准确、快速,且专属性良好,可用于蒺藜粗皂苷的质量评价。     

改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法，应用于霍乱监测。方法：根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，并进行特异性和灵敏度分析；同时以11种细菌作对照，建立改良分子信标检测霍乱弧菌的实时PCR反应体系，应用于霍乱监测。结果：霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌，只有霍乱弧菌有荧光信号，与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为102．4fg／ul，菌液灵敏度为32cfu／ml或3cfu／PCR反应体系。对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测，结果都为阴性。检测时间仅需2h。结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强，可用于霍乱的快速诊断，为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段。