葛根素抑制人成骨样MG-63细胞分泌IL-6的分子机制研究

目的研究葛根素(puerarin)抑制人成骨样MG-63细胞分泌IL-6的分子机制。方法利用兼有两种雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型表达的人成骨样MG-63细胞为研究模型,通过ELISA、RT-PCR、荧光素酶报告基因检测、小RNA干扰等方法,研究葛根素对MG63细胞产生骨吸收调节因子IL-6的作用及作用机制。结果葛根素可明显抑制MG-63细胞IL-6表达和IL-6基因启动子的转录活性,并且该作用可被纯ER阻断剂ICI 182,780部分阻断。采用小RNA干扰技术进一步证明葛根素对成骨细胞的上述作用是ERα依赖的。结论葛根素调节人成骨细胞产生IL-6主要是ERα依赖的。     

大豆异黄酮抗骨质疏松症的实验研究及作用机制的探讨

目的 观察大豆异黄酮的抗骨质疏松作用,并探讨其作用机制。方法 (1)切除10月龄大鼠双侧卵巢,3个月后分为己烯雌酚组、模型组、大豆异黄酮高、中、低荆量组,并灌胃,每日1次,连续3个月;用切除双侧卵巢旁部分脂肪的假手术同龄大鼠作对照(对照组)。测定各组动物的骨形态学指标、血清雌二醇(E2)、血清骨源性碱性磷酸酶(BALP)、血清钙磷、骨钙磷、尿钙磷以及子宫系数。(2)用含药血清培养成骨细胞,以MTT法检测成骨细胞增殖情况。结果 (1)大豆异黄酮能明显增加去卵巢大鼠骨小梁平均宽度、单位面积骨小粱骨细胞数、骨皮质平均厚度、股骨头平均吸光度和股骨干平均吸光度;明显升高血清E水平：明显降低血清BALP值;明显增加血清钙、骨钙含量：明显增加子宫系数。(2)大豆异黄酮能明显促进成骨细胞增殖。结论 大豆异黄酮具有明显的抗骨质疏松作用,其作用机制可能与其拟雌激素作用、提高体内雌激素水平、提高机体对钙的吸收与利用、促进成骨细胞DNA合成和生长增殖有关。     

大豆苷元对大鼠肠系膜动脉环的舒张作用及其机制

大豆苷元(daidzein)是一种异黄酮类化合物,流行病学及生物医学研究发现其具广泛的生物学作用,如雌激素样作用、抗心律失常、抗脑缺血、抗肿瘤等作用[1],对心血管亦有保护作用[2],本实验采用大鼠肠系膜动脉研究其对血管的作用.     

杜仲中槲皮素、京尼平苷及桃叶珊瑚苷对小鼠成骨样细胞系MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的 对杜仲抗骨质疏松的药效成分进行初步筛选。方法 采用小鼠成骨细胞MC3T3-E1体外培养模型, 通过MTT法测定细胞增殖, ELISA方法测定碱性磷酸酶(ALP)活性, 观察杜仲中槲皮素、京尼平苷及桃叶珊瑚苷对成骨细胞增殖和分化的影响。结果 槲皮素促MC3T3-E1细胞增殖的有效浓度为10^-6 mmol/L, 桃叶珊瑚苷则为10^-5 mmol/L;10^-4 μmol/L京尼平苷在干预后4 d, 才逐渐显现出促进MC3T3-E1增殖作用。槲皮素(10^-5、10^-3 mmol/L)、京尼平苷(10^-3 mmol/L)和桃叶珊瑚苷(10^-3 mmol/L)可增加MC3T3-E1 ALP活性。结论 槲皮素、京尼平苷和桃叶珊瑚苷可促进成骨细胞的增殖和分化, 且作用强度具有浓度相关性和时间相关性, 可能为杜仲抗骨质疏松的药效物质基础。     

低氧状态下红景天苷经HIF-1α信号通路调节人成骨样MG-63细胞表型表达的研究

目的研究低氧状态下红景天苷对成骨细胞表型表达的调控作用及其作用机制。方法 MTT法检测细胞增殖能力;采用Annexin V/PI双染法分析低氧诱导的细胞凋亡情况;磷酸苯二钠法检测成骨细胞分化的早期标志性基因碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR技术检测低氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、抑癌基因VHL蛋白(p VHL)、骨钙素(OC)、成骨细胞特异性转录因子Runx2及Osterix mRNA表达水平;采用ELISA法检测VEGF及OC的蛋白表达水平和I型胶原的含量;Western blot技术检测HIF-1α、p VHL、Osterix、Runx2的蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦显微镜技术观察HIF-1α的核转位情况;荧光素酶报告基因检测技术检测HIF-1α的转录活性。结果低氧状态下红景天苷促进MG-63细胞增殖,抑制由低氧诱导的MG-63细胞凋亡,促进Osterix、Runx2表达及通过增加ALP活性、Ⅰ型胶原和OC含量促进成骨细胞分化成熟。进一步研究发现,低氧状态红景天苷可下调HIF-1α的表达及核转位,而上调其转录活性及下游靶基因VEGF的表达。结论低氧状态下红景天苷通过调节HIF-1α/VEGF信号通路促进成骨细胞增殖和分化,同时抑制由低氧诱导的成骨细胞凋亡。     

大豆苷元耐缺氧的实验研究

目的研究大豆苷元对小鼠的耐缺氧作用.方法常压耐缺氧法、对抗异丙肾上腺素法、断头喘息法、结扎双侧颈总动脉法及游泳实验法.结果大豆苷元能显著延长常压耐缺氧条件下小鼠的存活时间;显著延长皮下注射异丙肾上腺素的小鼠在常压缺氧条件下的生存时间;显著性延长断头小鼠的喘息时间;显著延长脑缺氧时间和游泳时间.结论大豆苷元具有显著的耐缺氧作用.     

大豆苷元耐缺氧的实验研究

目的　研究大豆苷元对小鼠的耐缺氧作用。方法　常压耐缺氧法、对抗异丙肾上腺素法、断头喘息法、结扎双侧颈总动脉法及游泳实验法。结果　大豆苷元能显著延长常压耐缺氧条件下小鼠的存活时间;显著延长皮下注射异丙肾上腺素的小鼠在常压缺氧条件下的生存时间;显著性延长断头小鼠的喘息时间;显著延长脑缺氧时间和游泳时间。结论　大豆苷元具有显著的耐缺氧作用。     

大豆苷元对人非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖、迁移能力的影响及机制

目的探究大豆苷元(daidzein,Daid)对非小细胞性肺癌细胞株A549和H1299增殖、迁移能力的影响及可能机制。方法以A549和H1299为研究对象,CCK-8法检测Daid(0,5,10,25,50,100,200μmol·L^-1)抑制A549和H1299两种细胞的增殖情况。划痕和Transwell小室实验检测Daid对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测Cleaved Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ等的蛋白表达。结果与对照组相比,Daid在体外可明显抑制肺癌细胞的增殖,且抑制作用呈浓度依赖关系。Daid(100μmol·L^-1)可明显降低人肺癌细胞A549和H1299的迁移侵袭能力。Western blot结果显示,Daid(100μmol·L^-1)预处理后,两种肺癌细胞的Cleaved Caspase-3及LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高。结论Daid可抑制人非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖,使上述细胞的迁移侵袭能力明显下降,其机制可能与Daid诱导细胞凋亡及自噬有关。     

大豆苷元对氨茶碱在大鼠体内药动学的影响

摘 要 目的:研究大豆苷元对氨茶碱在大鼠体内药动学的影响。方法: 采用HPLC方法测定大豆苷元和氨茶碱合并给药组与氨茶碱单独给药组茶碱在大鼠体内的血药浓度,比较两者的药动学参数。结果:①茶碱在0.2～20.0 μg·ml^-1浓度范围内线性关系良好,定量下限为0.2μg·ml^-1,低中高3个浓度的绝对回收率分别为（86.7±4.2）%、（90.5±3.4）%和（92.4±4.6）%,相对回收率均大于90%,日间和日内精密度RSD分别小于8.94%、9.01%;②大豆苷元和氨茶碱合并给药组和单独给药组药动学参数分别为：半衰期（t_{1/2）为(123.63±18.23)和(133.94±11.20)min,曲线下面积（AUC(0-∞)）为(1 861.03±511.23)和(2 075.41±720.96) μg·min·ml^-1,AUC(0-8)为（1 749.71±376.68）和（1 963.34±475.84）μg·min·ml^-1,达峰浓度Cmax为(10.35±0.95)和(10.23±0.82)μg·ml^-1;③合并给药组较单独给药组的主要药动学参数峰值Cmax相似,t1/2、AUC有一定降低,但差异无统计学意义。结论:大豆苷元对氨茶碱在大鼠体内的药动学无明显影响。}     

Effects of Watercress Containing Rutin and Rutin Alone on the Proliferation and Osteogenic Differentiation of Human Osteoblast-like MG-63 Cells

Most known osteoporosis medicines are effective for bone resorption, and so there is an increasing demand for medicines that stimulate bone formation. Watercress (N. officinale R. Br.) is widely used as a salad green and herbal remedy. This study analyzed a watercress extract using ultra-performance liquid chromatography/mass spectrometry, and identified a rutin as one of its major constituents. Osteogenic-related assays were used to compare the effects of watercress containing rutin (WCR) and rutin alone on the proliferation and differentiation of human osteoblast-like MG-63 cells. The reported data are expressed as percentages relative to the control value (medium alone; assigned as 100%). WCR increased cell proliferation to 125.0±4.0% (mean±SD), as assessed using a cell viability assay, and increased the activity of alkaline phosphatase, an early differentiation marker, to 222.3±33.8%. In addition, WCR increased the expression of collagen type I, another early differentiation marker, to 149.2±2.8%, and increased the degree of mineralization, a marker of the late process of differentiation, to 122.9±3.9%. Rutin alone also increased the activity of ALP (to 154.4±12.2%), the expression of collagen type I (to 126.6±6.2%), and the degree of mineralization (to 112.3±5.0%). Daidzein, which is reported to stimulate bone formation, was used as a positive control; the effects of WCR on proliferation and differentiation were significantly greater than those of daidzein. These results indicate that WCR and rutin can both induce bone formation via the differentiation of MG-63 cells. This is the first study demonstrating the effectiveness of either WCR or rutin as an osteoblast stimulant.     

双氢青蒿素诱导人肿瘤细胞凋亡及其分子机制的研究

目的:研究双氢青蒿素诱导人白血病细胞凋亡作用及其机制。方法:用双氢青蒿素处理K562细胞,通过MTT比色法检测细胞增殖抑制的效果;荧光显微镜观察细胞的凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达,蛋白印迹技术(Western blot)检测线粒体、胞浆细胞色素C的表达。结果:双氢青蒿素处理K562细胞48h后MTT检测,570nm波长处测定半数细胞抑制浓度为8×10-5mol.L-1;Hoechst33342/PI双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞增殖抑制表现;RT-PCR检测到caspase-3的表达,Western-blot检测线粒体细胞色素C表达下调,胞浆中细胞色素C表达阳性。结论:双氢青蒿素能够在体外抑制人白血病细胞增殖并诱导其凋亡,而促进细胞色素C的释放,激活caspase-3可能是其作用机制之一。     

白屈菜红碱对人结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的：研究白屈菜红碱（Chelerythrine, CHE）对体外结直肠癌细胞的生长抑制作用,并探讨其作用机制。方法：MTT测定结肠癌细胞存活率,应用流式细胞仪检测CHE处理后ROS的积累和细胞凋亡情况,JC-1(5,5'',6,6''-四氯-1,1'',3,3''-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)荧光染料法检测细胞线粒体膜电位改变,应用荧光显微镜和Western blot法验证ROS积累诱导的线粒体功能障碍。结果：CHE对HCT-116和RKO细胞发挥剂量依赖性细胞毒作用,该作用与ROS介导的凋亡蛋白的表达有关。此外,CHE能够降低伴随线粒体功能障碍的线粒体膜电位。结论：CHE通过ROS介导的线粒体功能障碍和JNKs途径抑制CRC细胞生长并诱导细胞凋亡,提示CHE可能成为潜在的治疗CRC的候选药物。     

伪士的宁对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨伪士的宁对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响及其机制。方法:取人结肠癌HT-29细胞,随机分为空白组和低、中、高剂量伪士的宁组(125、250、500μmol/L),加入不含药培养基或含相应浓度伪士的宁的培养基培养48 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况和线粒体跨膜电位;采用Western blotting法检测细胞中P53、Caspase-3、Caspase-9、兔源DNA修复酶(c-PARP)、Bcl-2的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,低、中、高剂量伪士的宁组细胞凋亡率显著升高,线粒体跨膜电位均显著降低(P<0.01),且均呈现浓度依赖趋势。中、高剂量伪士的宁组细胞中P53、Caspase-3、Caspase-9、c-PARP蛋白表达水平较空白组均显著升高,低、中、高剂量伪士的宁组细胞中Bcl-2蛋白表达水平则显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:伪士的宁可能通过上调P53蛋白、下调Bcl-2蛋白的表达,改变线粒体膜电位,然后激活Caspase-3、c-PARP、Caspase-9的表达,进而激活内源性线粒体通路,发挥促进HT-29细胞凋亡的作用。     

Transglutaminase-2 Is Involved in Expression of Osteoprotegerin in MG-63 Osteosarcoma Cells

Osteoprotegerin (OPG) is a secreted glycoprotein and a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily. It usually functions in bone remodeling, by inhibiting osteoclastogenesis through interaction with a receptor activator of the nuclear factor κB (RANKL). Transglutaminases-2 (Tgase-2) is a group of multifunctional enzymes that plays a role in cancer cell metastasis and bone formation. However, relationship between OPG and Tgase-2 is not studied. Therefore, we investigated the involvement of 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate in the expression of OPG in MG-63 osteosarcoma cells. Interleukin-1β time-dependently induced OPG and Tgase-2 expression in cell lysates and media of the MG-63 cells by a Western blot. Additional 110 kda band was found in the media of MG-63 cells. 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate also induced OPG and Tgase-2 expression. However, an 110 kda band was not found in TPA-treated media of MG-63 cells. Cystamine, a Tgase-2 inhibitor, dose-dependently suppressed the expression of OPG in MG-63 cells. Gene silencing of Tgase-2 also signifi cantly suppressed the expression of OPG in MG-63 cells. Next, we examined whether a band of 110 kda of OPG contains an isopeptide bond, an indication of Tgase-2 action, by monoclonal antibody specifi c for the isopeptide bond. However, we could not fi nd the isopeptide bond at 110 kda but 77 kda, which is believed to be the band position of Tgase-2. This suggested that 110 kda is not the direct product of Tgase-2’s action. All together, OPG and Tgase-2 is induced by IL-1β or TPA in MG-63 cells and Tgase-2 is involved in OPG expression in MG-63 cells.     

肉桂酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响

目的研究中药有效成分肉桂酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和分化的影响。方法肉桂酸处理MG-63细胞前后,台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞仪检测细胞周期时相变化;光镜和电镜观察细胞形态和超微结构;VanGieson染色检测细胞Ⅰ型胶原表达;茜素红染色观察钙化骨结节形成;免疫细胞化学检测骨粘素和骨钙蛋白表达。结果肉桂酸明显抑制MG-63细胞增殖,D7抑制率达54.94%±4.69%。周期分析结果显示,肉桂酸处理后G0/G1期细胞比例较对照组明显升高(P<0.01)。光镜和电镜结果显示,肉桂酸处理组MG-63细胞形态和超微结构发生明显改变,呈现相应正常细胞的形态和超微结构特征。肉桂酸促进成骨细胞分化标志物Ⅰ型胶原、骨粘素和骨钙蛋白的表达与钙沉积以及典型骨结节的形成。结论肉桂酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖并诱导其向成骨细胞分化。     

千层纸素对人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的作用

目的 探讨千层纸素对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其可能机制.方法 用终浓度分别为0、12.5、25、50、100、200和400 μmol/L的千层纸素处理MG-63细胞.采用MTT法检测千层纸素对MG-63细胞增殖的抑制作用,透射电镜下观察千层纸素对细胞超微结构的改变,流式细胞术检测千层纸素对MG-63细胞凋亡率的影响,Western blot法分析半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9、B细胞淋巴瘤-白血病2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)的表达水平.结果 千层纸素呈时间-和剂量依赖地抑制MG-63细胞的增殖.电镜下可发现千层纸素能诱导细胞凋亡,表现为胞质内出现大量空泡,细胞核染色质固缩,细胞表面微绒毛减少.此外,千层纸素能剂量依赖性地诱导细胞凋亡,上调MG-63细胞中cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9和Bax蛋白的表达水平,下调pro-Caspase-3、pro-Caspase9和Bcl-2蛋白的表达水平.结论 千层纸素可诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡;这可能与升高Bax/Bcl-2比率、激活Caspase-9和Caspase-3蛋白有关.     

反义C-DNA对骨肉瘤细胞组织蛋白酶L表达的影响

目的 合成人组织蛋白酶L基因的反义脱氧寡核苷酸,观察其转染后对人骨肉瘤MG-63细胞系中CATL表达的影响.方法 免疫细胞染色观察人工合成正义、反义及无意义组织蛋白酶L基因片段转染人骨肉瘤细胞MG-63后组织蛋白酶L的表达,RT-PCR和Western blot检测组织蛋白酶L的mRNA和蛋白质的表达水平的变化.结果 组织蛋白酶L反义寡核苷酸对MG 63 细胞的组织蛋白酶L 的表达有明显的抑制作用,与正义链组、无意义链组和空白对照组相比差异有显著性( P＜0. 05). 结论 反义寡核苷酸的转染可阻遏骨肉瘤细胞中组织蛋白酶L的表达.     

卡维地洛对瘦素诱导的人肝星状细胞活化增殖的影响及机制研究

目的:研究卡维地洛对瘦素诱导的LX2人肝星状细胞(HSC-LX2)活化增殖的影响及机制。方法:取对数生长期的HSC-LX2细胞分为空白对照组、瘦素刺激组和卡维地洛低、中、高浓度组(5、10、20μmol/L),除空白对照组外,其余各组均加入0.1 g/L的瘦素及相应浓度的卡维地洛作用24 h。采用MTT法检测细胞的光密度(OD)值,计算细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、瘦素及瘦素受体m RNA表达;Western blot法检测磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,瘦素刺激组细胞的OD值增加、凋亡率降低、G_0/G_1期细胞减少(P<0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受体m RNA表达和p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均增强(P<0.05)。与瘦素刺激组比较,卡维地洛各浓度组细胞的OD值减小、凋亡率升高、细胞主要阻滞在G_0/G_1期(P<0.05);α-SMA、TIMP-1、瘦素、瘦素受体m RNA表达和p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均减弱(P<0.05),且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:卡维地洛能够抑制瘦素诱导的HSC-LX2细胞的活化增殖,促进HSC-LX2细胞凋亡;其机制可能与下调瘦素、瘦素受体基因表达并阻断瘦素诱导的细胞内JAK2/STAT3信号通路激活有关。