人动脉原位干细胞的生物学特性

作者前期工作已经证实，在人体的多种组织中均存在有一类分化潜能可与胚胎干细胞媲美的原始干细胞群体，其表型为CD105＋。目的：验证人的动脉是否也存在原位干细胞，并观察其分化潜能。设计、时间及地点：细胞观察实验。于2004-01／2007-01在河南省人民医院和中国医学科学院组织工程中心完成。材料：实验血管来源于流产胎儿，实验方案经河南省人民医院伦理委员会批准。方法：用MACS磁珠分选CD105＋细胞，应用极限稀释法获得单细胞克隆，观察其表型，在特定的诱导培养基中培养，用免疫荧光法和免疫印迹等方法检测其分化。主要观察指标：①干细胞表面抗原鉴定。②血管内皮、平滑肌细胞和脂肪细胞特异性抗原表达。结果：细胞的表型是CD105＋Flk1＋CD31＋αSMA＋，可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化。结论：人的动脉中存在着可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化的干细胞。     

成人骨髓多能成体祖细胞生物学性状及向成软骨样细胞的诱导分化(英文)

背景:骨髓多能成体祖细胞具有比骨髓间充质干细胞更强的分化潜能和扩增能力并具有胚胎干细胞样的多向分化潜能,但分化为成软骨样细胞的研究目前少见报道。目的:观察成人骨髓成体多能祖细胞的体外培养条件、生物学特性及其向成软骨样细胞分化的可能性。方法:观察体外培养成人骨髓成体多能祖细胞的形态、生长情况,并鉴定;以分化培养基诱导成人骨髓成体多能祖细胞向无软骨细胞分化。结果与结论: 光学显微镜下观察培养的成人骨髓多能成体祖细胞体积偏大,长多角型,数个细长伪足,细胞核大,细胞质丰富,细胞增殖能力旺盛;可见转录因子 4、阶段特异性胚胎表面抗原 1表达,未见 T 细胞表面黏附分子 CD44,CD45,CD133 和主要组织相容性抗原系统Ⅱ的表达;诱导分化后,分化细胞经甲苯胺蓝染色后呈异染性,可表达Ⅱ型胶原。证实,实验成功体外培养了成人骨髓多能成体祖细胞,骨髓多能成体祖细胞在一定诱导条件下具有向成软骨样细胞分化的潜能。     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。设计、时间及地点：单一样本实验，于2007—04／2008—01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。材料：5份羊水标本来自孕16～22周流产孕妇自愿捐献。方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h，细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72．88％、5．77％、21．35％；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。     

四色流式细胞术分析骨髓增生异常综合征原始细胞免疫表型

为了研究骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓原始细胞免疫表型特征，应用四色流式细胞术对常规设门及二次设门策略选取的29例MDS患者的骨髓细胞悬液中，CD34^＋细胞进行免疫表型分析。结果表明：①随着MDS的进展（RA／RAS→RAEB→RAEB—T），根据CD45／SSC图中选取的原始细胞群中，CD34^＋细胞比例逐渐增高．分别为8．0％、46．4％、76．8％，各亚型之间差别有显著意义（P〈0．05）。②在CD45 vs SSC散点图上，设门所取的原始细胞抗原表达随着RA／RAS→RAEB→RAEBT的进展，HLA—DR、CD13、CD33、CD117表达逐渐增高，CD15表达逐渐减低，差别均有显著意义（P〈0.05）。③在CD45VSCD34散点图上二次设门取CD34^＋原始细胞行抗原表达的分析，同样异常表达HLA—DR及髓系抗原CD13、CD33和CD117，比例高于常规分析法（P〈0．05），CD15比例减低，在RA／RAS中CD13、CD33、CD117和HLA—DR的表达较常规分析的原始细胞比例明显增高（P〈0.05），相关抗原的表达率在各亚型间差别无显著意义（P〉0．05）。结论：常规设门法能反映MDS疾病的进展，而二次设门策略则更能反映MDS原始细胞的生物学特征，CD34的异常表达代表原始细胞的不成熟性和异质性，在临床高度怀疑但形态学和细胞遗传学不能诊断时，原始细胞免疫分型对MDS的诊断更具意义。     

成年大鼠骨髓多能成体祖细胞的克隆化培养及其鉴定

目的优化培养条件，获得体外克隆化培养的成年大鼠骨髓多能成体祖细胞（rMAPC），并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法选择低血清条件培养基全骨髓直接贴壁法初步分离大鼠骨髓干细胞，用极限稀释法进行克隆化培养；用流式细胞术及免疫细胞化学法对克隆化培养的rMAPC进行表型分析，并进行体外成脂肪、成骨及成神经细胞诱导，RT—PCR检测Oct4及三个胚层早期标志物，确定其表型及分化潜能。结果单个细胞来源rMAPC在体外扩增至20代仍保持良好的生长状态；流式细胞术及细胞免疫组化检测结果显示CD71、α—SMA及Vimentin表达阳性；CD34、CD44、CD45表达阴性；细胞周期分析显示S＋G，＋M期细胞约占17％，而处于G0／G1．期的细胞占83％；rMAPC体外可被诱导向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞分化；RT—PCR检测到Oct4及三个胚层早期标志物的表达。结论体外克隆化培养的rMAPC能维持良好的干细胞生物学特性。     

成骨诱导或干扰素γ预处理对胎儿骨髓源Flk-1^＋间充质干细胞免疫活性的调节

背景：骨髓间充质干细胞在修复异基因组织最终分化为特定细胞后，理论上会因MHC及共刺激分子上调而引起组织排斥，但实际上并没有发生排斥反应。推测骨髓间充质干细胞在异基因组织分化诱导及炎性因子微环境作用下，有可能分化成一种仍具有免疫调节活性的终末细胞，不被机体的免疫识别系统清除掉。目的：在体外运用成骨诱导及干扰素γ预处理来模拟体内组织分化及炎性因子微环境，观察在此作用下胎儿骨髓源Flk-1^＋间充质干细胞是否能够保持其在自然条件下所呈现的免疫学活性。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-09／2008-05在北京协和医学院基础学院完成。材料：2例骨髓样品取自流产胎儿，由北京回龙冠妇产医院提供。外周血样品取自15～35岁健康志愿者，由北京三0七医院提供。地塞米松等诱导因子和干扰素γ为美国Sigma公司产品。方法：Ficoll法分离胎儿骨髓单个核细胞，取白环层以上细胞，以1×10^6／cm^2密度接种，贴壁法纯化，采用阴性分选法去除CD45^＋、GlyA^＋和CD34^＋细胞，分离扩增得到Flk-1^＋骨髓间充质于细胞。以淋巴细胞分离液梯度离心分离外周血单个核细胞，用于混合淋巴细胞培养实验及有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖实验。主要观察指标：流式细胞仪鉴定细胞表型，用成骨、成脂、成软骨和成内皮诱导液检测其分化潜能，成骨诱导或干扰素γ预处理后细胞表面抗原表达、对淋巴细胞增殖及活化抗原CD69、CD25表达的影响，对白细胞介素10和转化生长因子β分泌水平的影响。 结果：光镜下骨髓来源的间充质干细胞为成纤维细胞样贴壁生长，均高表达Flk-1。同时高表达黏附分子CD29、CD44、CD105，造血细胞标志CD34、CD45呈阴性：可向成骨、成脂肪、成软骨和成内皮方向分化：低表达MHC-Ⅰ类分子，不表达     

酸性成纤维细胞生长因子与胚胎干细胞的造血分化

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,酸性成纤维细胞生长因子可强烈表达。目的：探讨酸性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎干细胞造血分化的作用,在拟胚体培养阶段施加酸性成纤维细胞生长因子,验证酸性成纤维细胞生长因子对造血形成细胞产生的调控作用。方法：培养小鼠胚胎干细胞,将饲养层上生长状态良好的小鼠胚胎干细胞用胰酶消化成单个细胞后,利用悬滴法制备拟胚体,拟胚体继续悬浮培养,以1,2和50g／L酸性成纤维细胞生长因子分别培养3,5,7,9d,通过免疫荧光法检测胚胎干细胞与拟胚体中酸性成纤维细胞生长因子的表达,流式细胞术检测FIk-1^＋与CD133^＋阳性细胞率。结果与结论：酸性成纤维细胞生长因子在拟胚体中呈阳性表达。在5μg／L酸性成纤维细胞生长因子作用下,FIk-1^＋细胞随时间增加表达增加,CD133^＋细胞表达模式与FIk-1^＋细胞类似。在1μg／L时,FIk-1^＋细胞在7d时表达达到高峰,随后下降。CD133^＋细胞表达结果类似。而在2pg／L时,5d时FIk-1^＋细胞表达升高,随后下降,在9d时表达又增高。而CD133^＋细胞则总体呈现升高趋势。酸性成纤维细胞生长因子可促进FIk-1^＋与CD133^＋细胞的产生,证明酸性成纤维细胞生长因子能够有效促进拟胚体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究

本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC）,鉴定其生物学特性和多向分化潜能。取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞,采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC;分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期;进行多向分化潜能鉴定;传代培养达30代后,进行成瘤性检测。结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代,细胞仍保持多向分化潜能,细胞高表达CD29、CD44、Sca-1、MHC-Ⅰ,中度表达CD13、CD90.2,不表达CD117、CD45、Flk-1、MHC-Ⅱ类抗原。mMSC体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC,其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定,具有高度的增殖和多向分化潜能,无成瘤性。     

成体小鼠心脏Sca1+细胞体外分化潜能的实验研究

目的:研究成体小鼠心脏Sca-1~+细胞体外诱导分化的潜能。方法:利用免疫磁珠分选法分离成体小鼠心脏Sca-1~+细胞,通过BMP-2/FGF-4,TGF-β1及VEGF165等三种不同的体外诱导方法使其向心脏"三系"分化,并从细胞形态的变化、RT-PCR和免疫荧光染色等方面鉴定其分化潜能。结果:经BMP-2/FGF-4诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞发生形态改变,上调心肌细胞特征基因α-MHC、β-MHC、MLC-2a和MLC-2v的mRNA表达,同时表达心肌特征性蛋白cTNT和cMHC。经TGF-β1诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞亦发生形态改变,上调平滑肌特征基因α-SMA和Calponin的mRNA表达,同时表达平滑肌特征性蛋白SMA、sMHC和Calponin的表达。经VEGF165诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞同样发生了形态改变,上调内皮细胞特征基因CD31、vWF和VE-Cadherin的mRNA表达,同时表达内皮细胞特征性抗原CD31。结论:成体小鼠心脏Sca-1~+细胞在体外多种因素的分别作用下,能向心肌样细胞、平滑肌样细胞和内皮样细胞分化,具有心脏干细胞特性的多向分化潜能。     

脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型

背景:研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞,并表现出多向分化的潜能,但是关于其体外的生物学特性研究不够深入,其细胞表型的研究结果存在一定争议.目的:观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型.方法:取吸脂手术中废弃的人脂肪组织,胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞,体外传代培养,并进行细胞形态学观察,细胞生长曲线测定,免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型.结果与结论:脂肪来源的干细胞生长旺盛,呈成纤维细胞样生长,15代以内细胞形态未见明显变化;免疫组织化学染色显示,细胞表面标记CD29,CD44,CD105表达阳性,CD34,CD45表达阴性;流式细胞仪检测显示,CD29,CD44,CD105,MHC-1为阳性,CD3,CD14,CD19,CD31,CD33,CD34,CD45,CD106,CD117,CD184为阴性.结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛,高表达干细胞相关抗原,可长期传代且保持低分化状态.