pSFV1载体系统的改造

目的 获得具有多种稀有酶位点和CMVIE增强子/启动子及SV40晚期poly(A)加尾信号的pSFV1载体系统。方法 首先将含有多种稀有酶位点的人工接头插入到pSFV1的BamHⅠ和SmaⅠ位点（获得的载体称为mpSFV1)。然后在mpSFV1和辅助载体Helper2的SpeⅠ和SphⅠ位点分别插入SV40晚期poly(A)加尾信号和CMVIE增强子/启动子序列，以间接免疫荧光法检测构建的表达载体mpSFV1-A-CMV表达登革2型病毒PrME基因的效率。并用RT-PCR法鉴定辅助载体Helper2-A-CMV包装形成重组病毒的能力。结果 经PCR和酶切鉴定证明，接头，CMVIE增强子/启动子序列和SV40晚期poly(A)加尾信号序列均已导入pSFV1载体系统中；测序结果也与已知序列一致。间接免疫荧光法证明，PrME蛋白在BHK21细胞中获得了表达，同时，改造后的辅助载体也具有包装形成重组病毒的能力。结论 已将以RNA为基础的pSFV1载体系统构建成以DNA为基础的表达载体系统。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

转录作用的增强子

能明确调节转录的信号使对真核基因表达的了解前进了重要一步。RNA聚合酶Ⅱ转录的基因带有启动子成份,增强子(enhancer)或激活子(activator)是一套真核基因启动子,它可以提高邻近基因的转录效率,而和其所处的位置及方位(Orientation)无关。最先证实的典型增强子是SV_40 DNA和中串联重复的72个碱基对,位于早期基因,帽子位点上游100多个核苷酸处,缺失这个成份则T抗原早期基因的表达降低100倍,病毒活力同时丧失。以后发现SV_40的增强子以及从其他的动物病毒分离出来的同系物,不仅能对天然的同源基因起作用,而且也能和异源基因相结合而发挥功能。这个发现有助于解释Capecchi早     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

对比IL_1+IL_2和 IL_4对 CD_4~-CD8~-胸腺细胞的活化作用

IL1、IL2和IL4在早期T 淋巴细胞增殖分化过程中具有重要作用。作者采用从C_(57)BL/6小鼠纯化的CD_4~-CD_8~-胸腺细胞研究了IL_1、IL_2、IL_4在胸腺细胞成熟过程中的作用及机理。在高度纯化的。CD_4~-CD_8~-胸腺细胞中,分别加入IL_1+PMA、IL_2+PMA、IL_1+     

环胞霉素A抑制IL-2基因表达是由于抑制了淋巴细胞特异性因子与IL-2增强子的结合

环胞霉素A(CsA)是一种高效免疫抑制剂,它主要是在基因水平抑制T 细胞合成淋巴因子。本文发现CsA 是通过制淋巴细胞特异性因子与IL-2增强子(enhancer)结合的机制来抑制IL-2基因表达。作者将含有IL-2增强子—胸苷激酶(tk)启动子—CAT 结构基因的质粒转染入E14小鼠淋巴瘤细胞。TPA 和ConA 可诱导E14淋巴瘤表达CAT 基因,CsA 则抑制TPA和ConA 这种作用,而CsA 并不影响5×     

基因转录的反式调节

大多数基因至少含有两个调节部位,即启动子(promoter)和增强子(enhancer)。前者帮助准确决定DNA转录的起始部位;后者则控制启动子的转录速率。近年来,发现增强子是位于基因旁侧顺序远处的短DNA序列,以顺式调节(cis-regulation)作用于其邻近基因,发挥增强转录的作用;许多病毒及细胞的启动子则受反式作用调节(transregulation)[即其他基因编码的因子能识别一个DNA分子上的某个特异基因并使之开放,以这种方式调节基因表达的基因或产物称作反式作用因子(trans-acting fac-tor)]。目前发现有些病毒(如疱疹病毒、腺病毒和SV40)所编码的蛋白质不但能刺激病毒的启动子的转录,而且还能刺激兔的β-     

增强子与基因调控

引言增强子(enhanccr)是一类短的、顺式作用的正调节DNA序列。它们位于基因旁侧顺序的远处,能极大地增强其邻近基因的转录速率。文献中也有称之为调变子(modu-lator)或激活子(activator)的。目前,从病毒到真核细胞都发现有增强子存在。一般说来,增强子具有如下共同的特点:1.它们仅以“顺式”(cis)方式作用于基因的启动子;2.在启动子的上游或下游都可起增强作用;3.对启动子来说它们正向或反向排列均有效;     

骨髓前T、前B细胞表达有功能的IL_3及IL_4受体和无功能的IL_2受体

IL_3可维持B细胞前体生长,前B细胞持续增殖依赖于IL_3;近来又发现,重组IL_4(rIL_4)能加速14～15日龄胎鼠胸腺内T细胞前体增殖,还能使其分化为CTL;最近又     

IgH座位3′端B细胞第2个特异性增强

通常认为免疫球蛋白重链(IgH)基因的表达是通过V_H启动子和定位于J_H-C_H内含子的增强子联合调节的.但有些细胞系缺乏此内含子-增强子,仍能转录IgH基因。这提示在IgH座位上还存在其它     

人类白细胞介素2受体的研究进展

近年来的研究表明:活化的T、B~([1,3])、LAK~([4])、AK~([4])、Mφ~([10])等细胞都能表达白细胞介素。受体(IL_2R)。IL_2与淋巴细胞膜上的IL_2R结合是其增殖的重要条件。以往报导的活化T细胞膜上所表达的Tac分子是IL_2R~([1,13]),或者是IL_2R的一种     

重组质粒DNA在小鼠诱导产生保护性免疫力和预防乙型脑炎

构建含有乙脑病毒外膜蛋白前体 (Prm)和包膜蛋白 (E)基因的质粒载体 ,在巨细胞病毒的早期基因启动子的控制下 ,表达 Prm和 E蛋白。用这种质粒载体(JE- 4 B克隆 )转化的 COS- 1细胞在培养基中分泌乙型脑炎病毒 (JEV)特异性细胞外颗粒。对小鼠注射 1至 2针的重组质粒 DNA或 2针商用疫苗 JEVAX。所有接受注射 1针至 2针的 DNA疫苗的鼠 ,在初始免疫的 18个月中保持分泌 JEV特异抗体。JEVAX疫苗对于 3周龄鼠 10 0 %诱导血清转化 ,但是对于 3天龄鼠抗体检查ELISA滴度均不超过 1∶ 4 0 0。用这种 DNA疫苗免疫过的母鼠经空斑减少中…     

慢性丙型肝炎肝内细胞因子的信使核糖核酸（mRNA）表达率与慢性乙型肝炎的比较

开展本研究项目是为了验证这一假设,即在慢性肝炎的炎症过程中,包括病毒的复制,宿主的免疫反应和肝细胞的破坏是受一种肝内的细胞因子网络所调节。通过用逆转录聚合酶链反应的方法,调查二十例慢性丙型肝炎和九例慢性乙型肝炎的肝组织中,细胞因子IL1-β、IL_2、IL_4、IL_5、IL_6、TNF-α、IFN-r。淋巴细胞标记的CD_4和CD_8、HLAI类分子,B_2-MG的mRNA的表达。     

115 NFκB在Gata3基因表达和Th2细胞分化中的作用

ＮＦκＢ能调节哮喘病理过程中ＣＫ和粘附分子的表达 ,ＮＦκＢ基因缺失直接导致ＩＬ 13、ＩＬ 4和ＩＬ 5表达缺如。而Ｇａ ｔａ3是Ｔｈ2所表达的唯一的转录因子 ,它直接活化ＩＬ 5启动子 ,但对ＩＬ 13的作用是通过远端增强子完成的。那么 ,ＮＦκＢ与Ｇａｔａ3间是怎么一种关系呢 ?美国耶鲁大学医学院的戴斯对此做了研究。ＮＦκＢ的一个亚单位是ｐ5 0 ,缺失ｐ5 0的小鼠为ｐ5 0 / 小鼠。选取ｐ5 0 / 鼠与野生 (ＷＴ)鼠 ,腹膜内卵白蛋白 (ＯＶＡ)免疫后 ,并由ＯＶＡ激发哮喘发作。此时 ,取其气管灌洗液(ＢＡＬ) ,测其ＣＫ水平或取其脾淋…     

小鼠白细胞介素3活性检测影响因素的初步研究

<正> 白细胞介素3(Interleukin 3,IL_3)是近年来发现的淋巴因子之一。关于小鼠白细胞介素3活性检测目前有四种方法:(1)20-α羟基类固醇脱氢酶法;(2)鼠骨髓细胞集落形成试验;(3)鼠骨髓细胞H_3-TdR掺入法;(4)IL_3生长依赖株32D增殖~3H-TdR掺入法。这些检测方法以32D依赖株~3H-TdR     

纤维连结蛋白启动子的克隆及转录活性的研究

目的：克隆纤维连结蛋白（FN） 启动子和检测其转录活性，并初步研究增加SV40增强子对其转录活性的影响。方法:从正常人gDNA中克隆FN启动子，驱动氯霉素乙酰转移酶报告基因表达，构建成有SV40增强子和无SV40增强子两个重组体报告载体。利用脂质体介导的转染技术导入HT1080细胞，检测各重组体的瞬时表达，确定克隆FN启动子转录活性和SV40增强子对其转录活性的影响。 结果:克隆的FN启动子在HT1080细胞中活性比SV40启动子稍强，在加入SV40增强子时活性提高了约6倍。 结论:成功的克隆FN启动子，在HT1080细胞中有活性，通过增加SV40增强子能大大提高其活性，为运用FN启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了一定基础。     

人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体的构建及鉴定

构建人源性抗ＨＦＲＳ病毒基因工程抗体基因的表达载体,为其进一步在真核细胞中表达奠定基础。方法：经多次克隆将人源性抗ＨＦＲＳ病毒抗体可变区基因与启动子,增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真有达元件及人抗体恒定区基因和抗生素选标记基因相连接。     

痘苗病毒增强子样序列的筛选及应用研究

目的从痘苗病毒基因组中筛选原核增强子样序列，构建携带原核增强子样序列的表达载体，探讨其对干扰素基因表达的影响。方法采用氯霉素乙酰转移酶基因（cat）作为报告基因，从痘苗病毒基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列，构建携带增强子样序列VV1的表达载体，表达干扰素基因和检测干扰素活性。结果从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选出18个在大肠埃希菌中具有增强活性的序列，从中筛选到两个原核增强子样序列VV1和VV16，VV1正反向分别可使lacZ基因活性提高10．9倍和3．8倍，VV16正反向分别可使lacZ基因活性提高9．0倍和4．1倍；证实它们的增强活性体现在转录水平；用痘苗病毒增强子样序列VV1构建的表达载体，其表达的IFN—a2b型干扰素比原表达载体活性高2．6倍。结论从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到2个原核增强子样序列一携带有痘苗病毒增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平。     

马传染性贫血病毒基因表达调节机制的研究进展

马传染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus, EIAV)与HIV同属于逆转录病毒亚科慢病毒属, EIAVLTR被认为是影响病毒复制效率和决定病毒细胞嗜性的重要因素。在LTRU3区的增强子和启动子区域存在大量部分重叠的转录因子结合基序, 对病毒的复制起正负调节作用。但LTR并不是决定EIAV基因表达调节的唯一因素, 病毒自身编码的小分子蛋白Tat、Rev等均对病毒的复制水平有重要影响。我们对EIAV的基因表达调节机制进展做一概述。1　EIAVLTR高变异区主要集中在增强子区域EIAV长末端重复序列 (longterminalrepeat, LTR)较其它…     

IL_6受体特异性靶向传递重组IL_6-PE_(40)外毒素融合蛋白杀伤急性白血病

利用生长因子受体靶向传递重组生长因子外毒素融合蛋白特异性地杀伤肿瘤细胞是肿瘤靶向治疗的最新突破。业已表明急性粒细胞白血病异常高地表达IL_6R、GM-CSF_R和IL_3R,在白血病异常造血调控中发挥重要作用,因此可充分利用这些高表达的受体作为靶子,选择性地与重组IL_6-PE_(40)、IL_3-pE_(40)和GM-CSF-PF_(40)假单胞菌外毒素融蛋白结合,达到有的放矢的治疗白血病。在这些受体中,IL_6R显得特别重要,因为它仅表达于人的