抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建与表达

目的:探讨抗凝溶栓重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的构建效果与抗凝溶栓活性表达情况。方法:在间接实验中,选择p BV-重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质质粒进行酵母大量表达,再进行两级纯化分析;去纯化的单位进行抗凝溶栓的检测。结果:工程菌酵母发酵培养诱导1 h后就可以检测到重组葡激酶-水蛭素融合蛋白表达,表达量随发酵时间的增加而递增。两级纯化的重复性非常好,纯度经RP-HPLC测定在98%以上。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的溶栓活性明显高于水蛭素与葡激酶的单纯溶栓活性(P0.05)。重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有更强的纤溶酶原激活活性,明显高于水蛭素与葡激酶的单纯纤溶酶原激活活性(P0.05)。结论:重组葡激酶-水蛭素融合蛋白生产工艺具有很好的诱导与纯化效果,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白能发挥较好的抗凝与溶栓作用。     

重组葡激酶溶栓活性的实验研究

目的探讨重组葡激酶(r-Sak)的溶栓活性及对纤维蛋白溶解系统的影响。方法通过对家兔内膜受损颈动脉内注射凝血酶产生的富红细胞血栓形成动物模型(21只),分别给予0.5ml/kg生理盐水(NS)(对照组5只)、27500IU/kg尿激酶(UK)(阳性对照组8只)及27500AU/kg r-Sak(实验组8只),比较各组用药前、后颈动脉血流量(CBF)的变化及对纤维蛋白溶解系统指标的影响。结果r-sak对颈动脉富红细胞血栓产生明显的溶栓作用,与等剂量UK比较,出现再通所需时间短(18.3±5.9min VS 28.6±3.5min,P<0.01),实验组用药后CBF最大值(Max)与用药前CBF值的差(△)较阳性药对照组有显著性差异(5.14±0.61m1/min VS 3.31±0.95 ml/min,P<0.001);同时,r-Sak对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、α-抗纤维蛋白溶解酶(α-AP)活性、纤维蛋白原(Fg)、纤维蛋白溶解酶原(Pg)等凝血及纤维蛋白溶解系统指标均无明显影响(P>0.05)。阳性对照组和实验组中各有25％(2/8)发生了动脉穿刺点渗血,均于20min内自行停止。结论 国产r-Sak作为一种新型的纤维蛋白选择性溶栓剂,有可能为临床溶栓治疗提供新的手段,且无严重副作用,值得作进一步研究。     

重组葡激酶在急性心肌梗死中的溶栓疗效

目的 :观察重组葡激酶 (r SAK)在急性心肌梗死 (AMI)患者中的溶栓疗效。方法 :入选AMI患者 5例 ,年龄 <6 0岁 ,胸痛持续 <6h。冠状动脉造影 (CAG)明确梗死相关血管后 ,予r SAK 15mg静脉溶栓结合静脉肝素抗凝治疗 ,在溶栓后 15、30、45、6 0、90min ,1～ 2周重复CAG ,观察溶栓后梗死相关血管TIMI血流和残余狭窄 ,记录胸痛缓解情况、再灌注心律失常、ST段的演变、心肌酶峰值时间、相关并发症及心脏事件。结果 :CAG显示右冠状动脉近端病变和第一对角支近端病变各 1例 ;前降支近端病变 3例 ,溶栓前均完全闭塞。r SAK溶栓后血管再通率 10 0 % ,90min血流达TIMIⅢ级者 2例 ,TIMIⅡ～Ⅲ级者 2例 ,TIMIⅡ级者 1例 ,平均再通时间为(34 .0± 14.7)min。 5例均符合临床冠状动脉再通标准。随访中未见严重出血和心脏事件发生。结论 :r SAK 15mg静脉溶栓有较佳的效果 ,患者有良好的耐受性。     

葡激酶纳米脂质体的制备及靶向溶栓的实验研究

目的 探讨葡激酶(PK)纳米脂质体的溶栓效果.方法 采用逆相蒸发法制备PK纳米脂质体,并用反相液相色谱(HPLC)法制备归巢装置,观察PK纳米脂质体包封率、分散性、形态、大小,制备血栓动物模型,应用不同剂量的PK纳米脂质体导向装置,观察溶栓效果.结果 PK纳米脂质体平均粒径为(78.6±5.7)nm,多分散性指数为0.298.PK纳米脂质体包封率71.5%,回收率93.2%.分析10、20、30、40 min各个时间段,PK大剂量组与精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)-PK纳米脂质体在血压变化方面与对照组均有显著差异(P＜0.05),各实验组的血栓湿重与对照组比较均有显著差别(P＜0.001).其中PK纳米脂质体、RGDS-PK纳米脂质体与小剂量PK组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 制备PK纳米脂质体是可行的,RGDS有导向性,该归巢装置具有较好的溶栓效果.     

人护骨素-谷胱甘肽转硫酶融合蛋白基因的构建与表达

目的 克隆人护骨素(OPG)成熟肽段编码区基因并研究在大肠杆菌中OPG-谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合蛋白的表达。方法 采用RT-PCR从人骨肉瘤细胞系MG63的总RNA中扩增OPG成熟肽段编码区cDNA，构建原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌后经0．1mmoL／L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白，以SDS—PAGE电泳及Western印迹鉴定蛋白表达，应用谷胱甘肽-Sepharose4B柱亲和层析纯化目的蛋白。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，转化菌株可表达人OPG-GST融合蛋白，蛋白表达量约为菌体总蛋白的15．5％。Western印迹表明在相对分子质量66000处融合蛋白能与人OPG多克隆抗体特异性结合。经亲和层析后获得纯度为95．7％的OPG—GST融合蛋白。结论 获得人OPG成熟肽段全长cDNA，在大肠杆菌中表达OPG—GST融合蛋白并以亲和层析法进行纯化。     

pMAL-C2融合表达幽门螺杆菌HspA-UreB重组蛋白

幽门螺杆菌 (Hp)有效保护性抗原有多种 ,如 :热休克蛋白 (Hsp)、尿素酶 (Ure)、空泡毒素 (VacA)、毒素相关蛋白(CagA) 及过氧化氢酶等 ,但单独免疫动物时保护性均不理想 ,而使用多种抗原成分联合免疫 ,可使 10 0 %的小鼠避免感染Hp[1] 。本研究将Hp的两个主要抗原成分HspA和UreB的编码基因共同插入一个融合表达载体 pMAL C2 ,使其融合表达 ,为Hp基因重组疫苗的研究奠定基础。一、材料与方法1.质粒与菌株 :克隆质粒 pNEB193和融合表达载体pMAL C2购自NEB公司。大肠杆菌JM10 9系本研究室保存。Hp国际标准菌株NCTC116 37系张建中…     

大鼠髓样细胞表达激发受体-1／人IgG融合蛋白真核表达载体的构建表达与鉴定

目的 构建大鼠髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）/人IgG融合蛋白的真核表达载体,并在家蚕Bm细胞中实现稳定表达。方法 克隆大鼠TREM-1胞外段与人IgGFe段,片段连接后PCR扩增,再与病毒穿梭载体BAC1连接,基因克隆,构建重组质粒。利用杆状病毒表达系统（Bar-to-Bar）筛选重组杆状病毒,在Bm细胞中进行融合表达,并用Western blot法行蛋白鉴定。结果 重组质粒酶切测序正确,确认克隆载体构建成功。Western blot结果说明该蛋白样品可被抗大鼠TREM-1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM-1/IgG融合蛋白。结论 成功构建了大鼠TREM-1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。     

重组葡激酶对急性心肌梗死患者血浆GMP-140、TAT含量的影响

目的观察重组葡激酶(r-sak)和尿激酶(UK)溶栓治疗急性心肌梗死(AMI)对血小板的活化作用,评价其治疗AMI的临床疗效。方法将68例患者随机分为两组,r-sak组35例,以r-sak 10 mg静脉滴注溶栓;尿激酶组33例,以尿激酶150万U 30 min静脉滴注溶栓。测定两组溶栓治疗前、溶栓后2、24、48 h血浆中血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)含量等相关指标。结果 A、B两组治疗后2 h血浆中GMP-140均升高,尿激酶组血浆中GMP-140升高显著。r-sak组治疗后2 h血浆中TAT浓度升高不显著,尿激酶组治疗后2 h血浆中TAT浓度升高显著。结论 r-sak溶栓的疗效明显优于尿激酶,r-sak有更强的血栓选择性,对促凝活性微弱,出血并发症发生率少,促血小板活化低,减轻血栓前状态对心肌的损伤作用,可以改善心肌微灌注。     

重组水蛭素对兔髂总动脉球囊损伤后内膜增殖影响的实验研究

目的 :探讨重组水蛭素对兔髂总动脉球囊损伤后内膜增殖的影响。方法 :2 4只纯种日本大耳白兔随机分成肝素对照组 （n=12 ）和重组水蛭素组 （n=12 ） ,采用兔髂总动脉球囊扩张损伤后内膜增殖动物模型 ,术后 2周和 4周复查血管造影 ,术后 4周处死动物取髂总动脉标本。结果 :用药组术后 2周和 4周平均髂总动脉直径均较对照组明显增加 （P<0 .0 1） ,4周后新生内膜面积显著减少 （P<0 .0 1） ,管腔面积明显扩大 （P<0 .0 1）。结论 :重组水蛭素可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张损伤后新生内膜增殖和管腔的狭窄     

新型冠状病毒重组蛋白疫苗的构建、表达及鉴定

目的 利用毕赤酵母系统表达重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD,以期作为新冠病毒重组蛋白候选疫苗。方法 选择新型冠状病毒的RBD(受体结合域)蛋白为靶点,通过基因工程技术将RBD基因序列克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9K中。通过载体将外源基因整合到毕赤酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列,加入甲醇进行诱导,通过前导信号肽引导外源蛋白的分泌表达。结果 成功将RBD基因序列克隆到表达载体中并整合到酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。能通过前导信号肽引导目的蛋白的分泌表达,表达产物免疫动物刺激产生高水平的血清IgG抗体,IgG抗体效价为1∶2.73×10⁶。结论 重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD的设计具有可行性,为重组蛋白候选疫苗在预防新型冠状病毒感染中具有潜在的应用价值。     

Heymann肾炎RAP全长及氨基端融合蛋白表达载体的构建及表达

目的构建大鼠Heymann肾炎致病源RAP全长和氨基端多肽原核融合表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用RT—PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,筛选阳性克隆测序;设计针对RAP全长和氨基端的引物进行PCR扩增,获得相应的DNA。纯化后与PGEX-4T-1载体连接,亚克隆到感受态细菌B121中,经IPTG诱导,表达融合蛋白并纯化,经SDS-PAGE和Western Blot检验。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083/283,并表达出RAP全长70kD和氨基端36kD的融合蛋白。WesternBlot结果显示分别在70、36kD处出现特异性条带,与理论相符。结论RAP,083／258与pGEX-4T-1融合基因表达载体的成功构建及其融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为后续研究RAP不同区段在Heymann肾炎发病机制中的作用奠定了基础。     

布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE的克隆、表达及免疫诊断研究

目的分别构建含目的基因flgE和bls-flgE的原核表达载体,表达纯化重组蛋白,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从NCBI得到布鲁氏菌鞭毛钩蛋白基因flgE和2,4二氧四氢蝶啶合酶基因(bls)序列,设计引物,利用PCR技术扩增得到目的基因,与载体pET30a连接,转化E.coli BL21感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定,使用带His标签的蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。纯化后的蛋白建立ELISA法检测布病阳性血清和健康人血清,收集灵敏度和特异度数据。结果成功克隆了FlgE鞭毛钩蛋白和BLS-FlgE融合蛋白,经过优化表达条件,目的蛋白获得较大量的表达,免疫印迹结果显示可被阳性病人血清识别。以FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为70.83%和41.67%,以BLS-FlgE蛋白构建ELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为68.75%和52.08%。结论成功表达布鲁氏菌鞭毛钩蛋白FlgE和融合蛋白BLS-FlgE,分别作为诊断抗原总体符合率低,免疫诊断价值较低。     

小鼠组氨酰tRNA合成酶与麦芽糖结合蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的 在大肠杆菌中表达小鼠组氨酰tRNA合成酶(HARS)与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合基因,通过亲和层析纯化以获得具有抗原特异性的重组蛋白.方法 提取C57BL/6小鼠肌肉组织总RNA,反转录为cDNA,利用软件设计一对特异性引物,扩增HARS基因上游591对碱基序列.对扩增产物和载体质粒pMALc-5e分别进行双酶切,再用T4连接酶连接得到重组质粒.将其转化大肠杆菌感受态细胞,挑取单克隆培养并鉴定质粒序列.异丙基-β-D硫化吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达后亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳对融合蛋白进行相对分子质量粗鉴定,蛋白印迹法鉴定抗原特异性.结果 重组HARS-MBP融合蛋白基因在大肠杆菌胞质中高效表达,亲和层析纯化后的融合蛋白与预测相对分子质量66 000相符,与抗体具有良好的特异结合能力.结论 小鼠HARS-MBP融合基因能够在大肠杆菌中稳定高效地表达,表达的蛋白具有良好的抗原特异性,为后续炎性肌病的研究提供了基础.     

GST-hPlk2融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建GST-hPlk2融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hPlk2基因全长,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hPlk2,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果 酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒GST-hPlk2,并用Western blot方法证实了GST-hPlk2融合蛋白的表达.结论 成功构建了GST-hPlk2原核表达载体,并证实了其在原核细胞E coli中的表达,为进一步纯化Plk2及研究其结构与功能提供了前提基础.     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接，构建重组质粒，并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物，分别PCR扩增p24和gp41两个基因，将它们分别连接到pMD18-T载体中，测序验证后，挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18T载体中，再将连接后的两个基因酶切，重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达，经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。     

戊型肝炎病毒ORF3和标签His融合真核表达载体的构建与表达

目的体外构建HEV ORF3蛋白融合His标签的真核表达载体及其初步鉴定和蛋白表达。方法从1例男性31岁戊型肝炎患者血清中分离HEV RNA,逆转录合成cDNA,特异性引物扩增HEV ORF3片段,将其定向连接到pcDNA3.1(-）-His真核表达载体中,经抗生素筛选后,酶切及测序鉴定其序列正确性。采用提取质粒转染HepG2细胞,培养96 h后裂解细胞,采用抗His-Tag抗体进行Western blot检测目的蛋白。结果从戊型肝炎患者血清中成功分离出I型HEV RNA,经抗生素筛选、酶切鉴定和测序确认pcDNA3.1(-）-HEF3-His真核表达载体构建成功,转染HepG2细胞,经Western blot检测显示15 kDa位置有明显融合蛋白条带。结论成功构建了HEV ORF3与His标签融合的真核表达载体,体外转染HepG2细胞后鉴定其工作良好,为后续HEV ORF3蛋白的研究奠定了基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。     

酿酒酵母表达Sj23HD-HSA融合蛋白与免疫反应性分析

目的采用酵母表达技术制备日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白分子大亲水肽段（Sj23HD）与人血清白蛋白（HSA）成熟肽的融合蛋白（Sj23HD-HSA）,并分析其免疫反应性。方法应用重叠PCR方法构建编码Sj23HD-HSA融合蛋白的融合基因片段,通过TA克隆和DNA测序确定构建的融合蛋白基因序列的正确性。将融合基因定向插入酵母表达质粒pWX530中构建分泌型重组表达载体Sj23HD-HSA/pWX530。重组质粒转化酿酒酵母感受态细胞,在亮氨酸营养缺陷型培养基上筛选含重组质粒的酵母转化子菌落。对转化子酵母进行发酵培养,通过SDSPAGE分析酵母培养液上清中的蛋白成分,离子交换层析纯化培养上清中的Sj23HD-HSA蛋白成分。经免疫印迹分别与血吸虫病人、华支睾吸虫病人和健康人血清反应,确定酵母表达的Sj23HD-HSA融合蛋白的免疫反应性。结果 DNA序列分析显示,编码外分泌型Sj23HD-HSA融合蛋白的融合基因构建成功。含有Sj23HD-HSA/pWX530重组表达质粒的酵母转化子可以在非诱导条件下表达外分泌型可溶性的Sj23HD-HSA融合蛋白,其分子量大小与预期大小（73kDa）相近。免疫印迹分析结果显示,Sj23HD-HSA融合蛋白可以特异性地被血吸虫病人血清所识别,但与华支睾吸虫病人血清、健康人血清不发生反应。结论 Sj23HD-HSA融合蛋白被成功制备,并具有良好的特异性和免疫反应性,是一种有潜在价值的血吸虫病免疫诊断抗原。