宫颈癌组织中乳头瘤病毒感染及抑癌基因p53突变的检测

探讨人乳头瘤病毒１６，１８型感染及抑癌基因Ｐ５３突变与宫颈癌发生的关系。方法：应用ＰＣＲ及其单链构象多态性方法，对６０例宫颈癌组织ＤＮＡ进行检测，同时选择宫颈糜烂及正常宫颈各５０例作为对照。结果：宫颈癌组织中ＨＰＶ１６感染呈明显梯度关系，且鳞癌组织中ＨＰＶ１６的检出率远比腺癌高，并高于ＣＩＮ和正常宫颈组织；相反，腺癌中ＨＰＶ１８的检出率比鳞癌高。     

CRISPR/Cas9文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用

近年兴起的CRISPR/Cas9［Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9］技术因其能快速、简便、精准地实现基因敲除、敲入、激活、干扰等编辑功能而成为一种强大的遗传筛选工具,目前已在各类细胞系和小鼠及斑马鱼等多种动物模型中得到大规模运用。利用CRISPR系统构建基因组文库进行高通量筛选,是研究疾病特别是肿瘤靶标基因的主要策略。本文就CRISPR/Cas9文库筛选技术的原理和发展,脱靶效应的改进方案,文库筛选的基本流程以及近年来该技术在肿瘤研究中的应用进行总结。     

利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

目的：利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sgRNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo载体,与PB?CAG?rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。     

涎腺腺样囊性癌中相关抑癌基因的研究进展

涎腺腺样囊性癌（ACC）是一种发病率较高的涎腺恶性肿瘤,具有嗜神经侵袭和肺转移特性,其发生和发展是多个基因及产物共同作用的结果.传统治疗的效果并不理想,大量的临床研究已初步证实,ACC的癌细胞中存在多个抑癌基因启动子区的高甲基化,从而使细胞失去调控呈无限增殖.目前所研究的基因大多涉及癌细胞的发生、黏附、周期调控和信号转导等方面,对这些基因的研究关系到肿瘤的诊断、治疗及预后评价.     

卵巢肿瘤中pl6抑癌基因的表达及意义

目的：研究抑癌基因ｐｌ６与卵巢肿瘤发生与发展的关系。方法：用免疫组化ＡＢＣ法检测了３８例卵巢癌、２２例良性或交界性卵巢肿瘤及１２例正常卵巢组织中抑癌基因ｐ１６的表达情况。结果：ｐｌ６在恶性卵巢肿瘤中检出率为（７．８９％），明显低于良性肿瘤（６０％，Ｐ＜０．０１）、交界性肿瘤（６６．６７％，（Ｐ＜０．０１）及正常卵巢组织（８３．３％，Ｐ＜０．０１），在肿瘤分化差、恶性程度高及复发和死亡的病例中未检出ｐ１６阳性者。结论：ｐ１６作为一种新型的抑癌基因，它的突变与缺失可能与卵巢恶性肿瘤的发生发展密切相关（ｒ＝－０．９０５２，Ｐ＜０．０５）。     

早期肺腺癌中关键驱动基因及抑癌基因的研究进展

肺癌在恶性肿瘤中具有极高的发病率及致死率,给全球造成了沉重的社会经济负担,而肺腺癌是肺癌的主要类型。尽管肺腺癌患者预后差,但大部分早期肺腺癌具有较高的5年生存期。因此,对早期肺腺癌患者进行个体化评估、判断预后以及选择个体化治疗方案非常重要,同时肺癌关键驱动基因及抑癌基因的相关研究也引起了热议。本文综述了肺癌的五个关键基因,即驱动基因〔表皮生长因子（EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、c-ros原癌基因1络氨酸激酶（ROS1）、Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（KRAS）〕及抑癌基因（TP53）,对其在早期肺腺癌患者中的临床特征、预后、治疗及与其他生物小分子关联进行描述及总结,以期提高全科医生对于早期肺腺癌关键基因的认识,更好地对早期肺腺癌患者进行个体化管理。     

食管癌中抑癌基因PTEN的表达及临床意义

目的探讨抑癌基因PTEN在食管癌中的表达及临床意义。方法用免疫组织化学方法检测80例食管癌及其相应的手术远端正常食管组织中PTEN蛋白的表达水平。结果PTEN在食管鳞癌中的表达率明显低于癌旁正常食管黏膜组织(P<0.01),而且PTEN蛋白表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关(P<0.01)。结论从蛋白水平证明PTEN基因表达缺失或突变在食管鳞癌的发生发展中可能起重要作用,PTEN蛋白表达的检测可作为临床治疗和判断预后的依据。     

TEAD1基因敲除对糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响

目的 利用CRISPR/Cas9技术敲除糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMCs）中TEAD1基因,探讨TEAD1基因对糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型转化的影响。方法 利用链脲佐菌素建立糖尿病性ED大鼠模型。原代及传代培养CCSMCs,并进行免疫荧光染色鉴定。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA（sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3）,构建表达载体并转染293T细胞,包装并收集慢病毒,将其感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western blot检 测TEAD1蛋白的表达水平。然后将实验分3组：敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs为实验组（CCSMCs-sgRNA-2）、空载体病毒感染组为阴性对照组（CCSMCs-sgRNA-NC）、不感染病毒组为空白对照组（CCSMCs-CK）,分别使用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞表型标志物平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）、碱性调宁蛋白（Calponin）和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA和蛋白水平的表达。结果 原代培养的糖尿病性ED大鼠CCSMCs α-SMA阳性细胞率达95%以上。成功包装了含有TEAD1-sgRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs细胞系。Western blot结果显示感染TEAD1-sgRNA-2的糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1蛋白水平最低（P<0.05）。qRT-PCR和Western blot结果显示,敲除 TEAD1 基因的糖尿病性 ED 大鼠 CCSMCs,SMMHC 和 Calponin mRNA 和蛋白水平的表达均显著上调（P<0.05）,而PCNA mRNA和蛋白水平的表达均显著减少（P<0.05）。结论 利用CRISPR/Cas9基因技术成功构建了定向敲除TEAD1基因的慢病毒载体,TEAD1基因的缺失可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型从合成型向收缩型转化。     

基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法 利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果 PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81...     

SUZ12过表达及敲减恶性外周神经鞘瘤稳定细胞株的建立及其意义

目的:构建SUZ12基因过表达和敲减的恶性外周神经鞘瘤(MPNST)稳定细胞株并探讨其意义。方法:PCR合成SUZ12基因全长并设计合成SUZ12基因的3对特异性sgRNA干扰靶点序列（sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3）,构建重组表达质粒,转染293T细胞,包装慢病毒颗粒并用荧光法测定其滴度。确定慢病毒感染的最适MOI以及嘌呤霉素筛选的最适剂量,转染ST88-14细胞,构建过表达及敲减的MPNST稳定细胞株。荧光显微镜观察稳定株绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR在mRNA水平进行验证,MTT法检测SUZ12过表达和敲减组增殖活性的改变。结果:LV-SUZ12和LV-SUZ12-sgRNA转导入ST88-14细胞并稳定表达绿色荧光蛋白,RT-qPCR结果显示过表达稳定株SUZ12表达量明显升高（P<0.05）,CRISPR/Cas9敲减稳定株SUZ12表达量明显下降（P<0.05）。MTT结果显示过表达SUZ12基因抑制MPNST细胞的增殖。结论:SUZ12过表达和敲减的稳定细胞株构建成功,初步验证结果表明过表达SUZ12基因抑制MPNST细胞的增殖,为针对SUZ12在MPNST中的生物学功能、作用机制和疾病诊断治疗的进一步研究提供了实验基础。     

肺癌组织3号染色体短臂上抑癌基因异常改变的初步分析

目的 探讨3号染色体短臂上的抑制基因Fhit,hMLH1及VHL在肺癌发展中的可能作用。方法 选取上述基因内含子或附近的微卫星多态位点对45例肺癌组织进行杂合性缺失（LOH）分析,并对其中17例进行了Fhit蛋白的免疫组化染色。结果 Fhit基因内含子3个位点D3S1234、D3S1300及D3S4103的杂合率分别为77．8％（35／45）、73．3％（33／45）和82．2％（37／45）,LOH阳性率分别为62．9％（22／35）、63．6％（21／33）和59．5％（22／37）。与hMLH1基因连锁的两个位点D3S1561、D3S1612杂合率分别为48．9％（22／45）、42．2％（19／45）,LOH阳性率分别为54．5％（12／22）和63．2％（12／19）。与VHL基因连锁的两个位点D3S1038、D3S1283的杂合率分别为62．2％（28／45）和80．0％（36／45）,LOH阳性率分别为64．3％（18／28）和41．7％（15／36）。17例肺癌组织有64．7％（11／17）Fhit蛋白表达缺失。在Fhit蛋白缺失的11个病例中,有10例存在一个或多个Fhit基因位点的LOH。结论 上述3个抑癌基因存在的高频率LOH可为肺癌的早期诊断提供新的途径和依据。Fhit基因的杂合性缺失可能是Fhit蛋白表达下调的机理之一。     

应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究

目的 使用基因芯片技术研究肺鳞癌及化学致癌物诱导入气管上皮细胞恶性转化的癌变相关基因。方法 应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片分别检测6例肺鳞癌和6例正常肺组织的基因表达谱;并用上述芯片研究苯并(a)芘代谢产物BPDE[anti-Benzo(a)pyrene diolepoxide,BPDE]和结晶型硫化镍所诱导的人支气管上皮细胞恶性转化与正常的人支气管上皮细胞系(16HBE)在基因表达谱上的差异;将3类标本共同的差异表达基因确定为肺癌变的相关基因。结果 在肺鳞癌／正常肺组织之间、BPDE诱导的恶性转化细胞／正常16HBE细胞之间及硫化镍诱导的恶性转化细胞/正常16HBE细胞之间发现差异表达基因分别为171条、143条和151条。通过比较,发现89条与肺癌变相关的共同基因,其中表达显著增加的基因39条,它们是：癌基因6条;细胞周期相关基因4条;细胞增殖基因6条;肿瘤转移基因8条;神经内分泌基因3条;耐药基因1条;凋亡抑制基因1条;氧化基因1条;其他基因9条。表达显著下降的基因50条,它们是：抑癌基因7条;DNA修复基因11条;抗氧化基因1条;GST基因家族3条;细胞骨架基因3条;凋亡诱导基因2条;信号传导基因5条;细胞因子及其受体基因5条;细胞代谢基因7条,细胞外基质基因1条;其他基因5条。结论 cDNA基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱,筛查出肺癌变相关基因。     

老年性白内障与正常晶体上皮细胞中差异表达基因的筛选

目的：筛选老年性白内障与正常晶体上皮细胞的差异表达基因．方法：利用改良消减杂交法获得差异cDNA，利用PCR法扩增其中大片段差异cDNA，将其克隆入质粒载体，通过反向点杂交排除假阳性克隆后，阳性克隆测序与GenBank中的序列进行比较，新序列进行计算机分析。结果：在库中随机挑选约600个克隆酶切鉴定，获得≥750bp片段400个。经反向点杂交，排除假阳性克隆后，共得到阳性克隆150个；测序的50个片段中，有30个已知基因(包括20个功能已知基因、10个序列已知但功能未知基因)，3个新序列．新序列中有一个的氨基酸序列与假想的锌指蛋白有45％同源性，可能参与细胞生长调控与代谢．结论：改良消减杂交法可以快速有效地获得老年性白内障差异表达基因，对稀有基因及新基因的发现与功能鉴定有重要意义。     

抑制小鼠乳腺肿瘤转移microRNA的筛选

目的鉴定25种microRNA的功能及其在乳腺癌中发挥的作用,以筛选新的抑制乳腺癌转移的microRNA分子。方法利用脂质体2000将25种鼠源microRNA表达载体转染至4TO7细胞,经G418筛选结合流式细胞仪分选获绿色荧光细胞得稳定表达鼠源microRNA的细胞株。将细胞2×105个/只尾静脉注射接种于BALB/C小鼠,14 d后解剖分离肺组织,统计小鼠肺组织结节数目。结果和接种阴性对照细胞小鼠相比,接种mir-449a稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移减少。而接种mir-1935稳转细胞的小鼠肿瘤肺转移增多。其它23种microRNA稳转细胞接种小鼠肿瘤肺转移既不增加也不减少。结论从25种鼠源microRNA中筛选到2种与乳腺癌肿瘤转移相关的microRNA:mir-449a抑制乳腺癌细胞肺转移,mir-1935则促进癌细胞肺转移。     

上皮性卵巢肿瘤抑制基因nm23的表达

应用免疫组化技术ＡＢＣ法检测了５例正常卵巢，２１例腺瘤，１０例交界性肿瘤和４０例卵巢癌及１９例大网膜转移灶等不同阶段组织ｎｍ２３蛋白的表达。结果发现：正常卵巢上皮、腺瘤、交界性肿瘤和卵巢癌组织中ｎｍ２３表达率分别为：２０％、６６６７％、１００％和５０％。交界性肿瘤ｎｍ２３表达同卵巢癌和腺瘤间差别显著（均Ｐ＜００５）。而原发灶和其相应大网膜转移灶ｎｍ２３蛋白表达基本一致。随着卵巢癌组织学级别升高，ｎｍ２３的表达呈下降趋势，Ⅰ级癌ｎｍ２３表达率显著高于Ⅱ、Ⅲ级癌（Ｐ＜００５）。提示：ｎｍ２３基因与卵巢癌的发生有关，并在卵巢癌的细胞分化过程中起调节作用。     

上皮性卵巢肿瘤P53的表达

为了解卵巢癌变过程中Ｐ５３的变化及其意义，应用免疫组化技术，研究了５例正常卵巢，２１例卵巢腺瘤，１０例交界性肿瘤，４０例上皮性卵巢癌及１９例大网膜转移灶组织中Ｐ５３蛋白的变化。结果发现：Ｐ５３表达仅见于卵巢癌组织中，浆液性癌的阳性表达率（１５／２２）显著高于粘液性癌（３／１３）和子宫内膜样癌（１／５）（Ｐ＜００５）；Ｐ５３在卵巢癌原发灶和其相应大网膜转移灶中的表达基本一致；Ｐ５３标记指数与卵巢癌组织学分级有关，Ⅱ、Ⅲ级癌的Ｐ５３标记指数显著高于Ⅰ级癌（Ｐ＜００５）。结果提示：Ｐ５３蛋白聚集变化主要发生在卵巢癌变的晚期，Ｐ５３表达有助于良恶性病变的鉴别；卵巢癌为单中心起源；Ｐ５３标记指数与卵巢癌的组织学分级呈正相关     

视黄酸对肿瘤坏死因子α诱导肺泡上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549增殖凋亡的影响与视黄酸(RA)对其调控作用。方法用不同浓度的TNF-α、1μmol/LRA和10μg/LTNF-α+1μmol/LRA处理肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞24h和48h后MTT法测定细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡。用10μg/LTNF-α处理24h或48h后继续培养,用台盼蓝染色计算24、48和72h活细胞数。结果分别用0、0.1、1、5、10μg/L浓度的TNF-α培养A549细胞24h和48h测定细胞增殖数(%):24h分别为95.0%、90.0%、79.6%、72.4%和59.6%,方差分析结果F值为18.04,P<0.01;48h分别为93.2%、82.7%、61.5%、50.3%和44.7%,F值为40.61,P<0.01。用10μg/LTNF-α处理A549细胞24h,其对细胞的增殖抑制作用可逆转,但处理48h后的A549细胞增殖抑制作用不能逆转。用TNF-α和视黄酸培养A549细胞12、24与48h后,凋亡的细胞数(%)TNF-α组分别为14.3%±3.2%、18.6%±2.9%和43.4%±3.5%,与对照组(6.3%±1.2%,8.2%±1.3%和26.1%±2.5%)比较差异有统计学意义;视黄酸加TNF-α组为4.8%±1.1%,5.2%±1.3%和16.4%±2.3%,明显少于TNF-α组。结论视黄酸通过抑制TNF-α对肺泡Ⅱ型上皮细胞的破坏,可以达到减轻肺泡上皮细胞损伤,保护肺表面活性物质的作用。     

抑癌基因WAF_1在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其意义

采用免疫组织化学技术，对５９例卵巢上皮性肿瘤及１１例正常卵巢组织中ＰＷＡＦ１２１蛋白的表达进行对比研究。结果显示：ＰＷＡＦ１２１蛋白在上皮性卵巢癌中表达下调，且与肿瘤细胞的分化程度，淋巴转移及患者的预后有关；它的缺失可能影响整个卵巢癌的发生和发展过程     

胃癌组织中相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态

目的分析胃癌组织中肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态及其与临床分期、分型的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应方法,检测106例胃癌及其邻近胃小凹上皮、16例慢性胃炎小凹上皮石蜡标本中E钙黏素（E—CD）、错配修复酶hMLH1、APC和6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化状态,并对其中46例胃癌采用免疫组化方法检测E—CD蛋白表达情况。结果在胃癌、胃癌邻近小凹上皮及慢性胃炎小凹上皮中,基因甲基化频率分别为72．6％（77／106）、44．3％（47／106）和12．5％（2／16）,三者问差异有统计学意义（P〈0．01）。Laurén弥漫型胃癌甲基化（80．6％,50／62）明显高于肠型胃癌甲基化（61．4％,27／44）,两者间差异有统计学意义（P〈0．01）。甲基化与患者的年龄、性别、Ming分型及区域淋巴结转移无关（均P〉0．05）,甲基化与胃癌的浸润深度、pTNM分期和分化程度有关（均P〈0．05）。行E—CD蛋白检测的46例胃癌中,22例有E—CD基因甲基化,其中20例（90．9％）E—CD蛋白呈异质性减弱或基本消失表达;24例无E—CD基因甲基化,其中9例（37．5％）E—CD蛋白呈异质性减弱或基本消失表达,两者间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论上述肿瘤抑制基因启动了区甲基化可能是胃癌发生的早期事件。胃癌E—CD基因甲基化与E—CD蛋白异质性减弱或消失表达密切相关。     

PTEN蛋白及P53蛋白在子宫内膜癌中的异常表达

目的 探讨子宫内膜癌组织中抑癌基因PTEN、P53的异常表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测子宫内膜单纯性增生20例、子宫内膜复杂性非典型增生20例、子宫内膜癌35例中PTEN及P53的表达,表达率的差异采用卡方检验.结果 PTEN在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的表达缺失率逐渐上升,表达缺失率与组织学分级有关,差异有统计学意义(0.05).P53在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的阳性表达率逐渐上升,阳性率与组织学分级有关,差异有统计学意义(0.05).结论 PTEN、P53均与子宫内膜癌的发生、发展有关.