橄榄苦苷对破骨细胞增殖影响的实验研究

目的探讨橄榄苦苷不同药物浓度及不同作用时间对破骨细胞增殖的影响。方法破骨细胞的制备,采用sRANKL与M-CSF诱导小鼠单核细胞RAW264.7细胞获得破骨细胞。设置实验组:4组分别加入400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL橄榄苦苷,另设空白对照组。运用抗酒石酸酸性磷酸酶染液试剂盒进行破骨细胞TRAP染色鉴定,并采用Cell Counting Kit法(CCK法)检测应用不同浓度橄榄苦苷及不同作用时间抑制破骨细胞增殖的情况。结果与空白对照组比较,400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL橄榄苦苷对破骨细胞的增殖均具有明显抑制作用。当药物作用时间为24 h及72 h时,400μg/mL橄榄苦苷对破骨细胞增殖的抑制作用最强,当药物作用时间为48 h时,200μg/mL橄榄苦苷对破骨细胞增殖的抑制作用最强,差异有统计学意义(P0.05);50μg/mL橄榄苦苷对破骨细胞的增殖无明显抑制作用,差异不具有统计学意义(P0.05)。结论橄榄苦苷可能通过破坏破骨细胞细胞膜的完整性抑制破骨细胞的增殖。     

人胎盘提取物对成骨细胞增殖、分化、矿化及骨愈合的实验研究

目的研究人胎盘提取物(human placenta extract,HPE)对体外成骨细胞的增殖、分化、矿化的影响,进一步了解HPE促进骨折愈合的机理。方法用成骨细胞系(h Fob1.19细胞),通过CCK-8、流式细胞术、Real-Time PCR法分别检测不同剂量的HPE(0、18μl、100μl、180μl、360μl)在不同时间对成骨细胞增殖的影响;通过检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)观察不同剂量的HPE和Rhbmp-2(0、18μl HPE、100μl HPE、100μl Rhbmp-2、100μl HPE+100μl Rhbmp-2)在不同时间对成骨细胞分化的影响;通过茜素红染色检测不同剂量的HPE(0、50μl、100μl、200μl)在不同时间对成骨细胞矿化的影响,系统研究体外HPE对成骨细胞增殖、分化、矿化的影响及其促进骨愈合的可能机制。结果空白对照组和加入不同剂量的HPE各组对成骨细胞的增殖、分化未观察到明显的影响(P0.05),而加入不同剂量的HPE(50μl、100μl、200μl)各组对成骨细胞的矿化比空白对照组有明显促进作用(P0.01)。结论体外HPE对成骨细胞的增殖、分化无明显影响,对成骨细胞的矿化有明显促进作用;HPE促进成骨细胞矿化可能是促进骨折愈合机制。     

橄榄苦苷对成骨细胞OPG/RANKL mRNA的影响

目的 通过测定橄榄苦苷对成骨细胞OPG/RANKL mRNA的表达,探讨其治疗骨质疏松症的机制。方法 运用荧光定量PCR技术（RT-PCR）检测不同浓度橄榄苦苷不同时间对成骨细胞OPG/RANKL mRNA 表达量。结果 与阴性对照组比较,RT-PCR 结果显示不同浓度的橄榄苦苷均能促进OPG mRNA的表达,并且抑制成骨细胞RANKL mRNA 的表达。结论 橄榄苦苷可能通过抑制RANKL分泌来降低破骨细胞活性,同时促进成骨细胞分泌OPG,使之与RANKL结合增多,间接作用于破骨细胞,使其活性降低,而达到治疗骨质疏松的目的。     

乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的观察乳铁蛋白(Lf)对大鼠成骨细胞增殖分化的影响,初步探讨Lf对成骨细胞的作用机制。方法用不同浓度的Lf干预成骨细胞,在不同时间分别测定细胞数目的增殖、细胞内碱性磷酸酶活性,并用半定量RT-PCR法检测成骨细胞内RANKL/OPG mRNA基因的表达。结果Lf呈时间和浓度依赖性地促进大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性,每组实验在不同时间的差异均有显著的统计学意义(P<0.05),其中400μg/ml组在72h时细胞增殖数目达到最大。在碱性磷酸酶活性方面,400μg/ml组在72h时则有所下降。不同浓度Lf、不同作用时间均能促使成骨细胞中OPG mRNA表达增加,同时抑制RANKL mRNA表达。结论Lf能促进成骨细胞的增殖分化,并且能够调节成骨细胞RANKL/ OPG mRNA表达,从而抑制破骨细胞介导的骨吸收。     

蛇床子素骨靶向药物对体外培养大鼠成骨 细胞增殖功能的影响

目的观察以壳聚糖衍生物（NSC)为载体,与蛇床子素（OST)共价结合后形成的具有亲骨性 和亲水性的新型化合物一蛇床子素骨靶向药物（NSC-OST)对体外培养大鼠成骨细胞（Osteoblast ,OB) 增殖功能的影响,探讨其防治骨质疏松的作用机制。方法取新生大鼠颅盖骨进行OB分离、培养, 采用碱性磷酸酶（ALP)染色及茜素红染色法鉴定OB;随机将OB分为5组,即空白对照组及终浓度 为 10—7mmol/L、10 ―6 mmol/L、10-5 mmol/L、10 ―4 mmol/L NSC-OST 实验组,分别加人不同浓度的 NSC-OST作用不同时间,用MTT法检测成骨细胞增殖情况。结果体外分离培养的细胞具有典型成 骨细胞形态学及生物学活性,碱性磷酸酶、茜素红染色均呈阳性结果;作用M h、48 h时,终浓度为 10—5 mmolL NSC-OST 可显著促进 OB 增殖（P <0. 05 ),作用 72 h,终浓度为 10-6mmol/L 和 10-5 mmolLNSC-OST可显著促进OB增殖（尸<0. 05 );终浓度为10—4mmol/L NSC-OST具有明显抑制OB 增殖的作用（P<0.01 )。结论 NSC-OST的水溶性良好,理化性质稳定,适当浓度的NSC-OST可促进 成骨细胞增殖,有望成为有效抗骨质疏松作用的新型药物。     

山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞的增殖及成骨分化的影响

目的基于Wnt信号通路及内质网应激研究山茱萸新苷Ⅰ对大鼠原代成骨细胞的增殖及成骨分化的影响。方法提取原代成骨细胞,CKK8实验检测在药物浓度下山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞ALP的活性情况; Real-time PCR检测Wnt2、β-catenin、BMP2、OPG、NOX4、PERK基因mRNA的表达; Western blot检测Wnt2、β-catenin、PDI、CHOP和BIP蛋白表达量。结果 CKK8实验及ALP染色表明山茱萸新苷Ⅰ对成骨细胞增殖及分化有一定影响,不同浓度山茱萸新苷Ⅰ干预下成骨细胞出现不同程度的增殖;与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG、NOX4的mRNA表达水平显著升高(P0. 01),而PERK明显降低(P0. 01)。与空白对照组相比,山茱萸新苷Ⅰ组的成骨细胞Wnt2、β-catenin、PDI蛋白表达量显著升高(P0. 01),CHOP表达亦有轻微上升,但不明显(P0. 05),而BIP的蛋白表达水平明显降低(P0. 01)。结论山茱萸新苷Ⅰ浓度为1 mmol/mL时在促进成骨细胞的增殖分化的作用上表现最佳,其能显著升高成骨细胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表达水平,而降低PERK的mRNA表达水平,升高Wnt2、β-catenin、PDI的蛋白表达量,降低BIP的表达量,在山茱萸新苷Ⅰ的干预下,Wnt信号通路及内质网应激途径对成骨活动的发生发展起着重要作用。     

不同浓度锌对成骨细胞MC3T3-E1骨保护素基因表达和细胞增殖的影响

目的 研究不同浓度锌对成骨细胞骨保护素基因表达和细胞增殖的影响.方法 取小鼠的成骨细胞系MC3T3-E1培养并随机分为4组,A组加入10μ mol/L硫酸锌;B组加入50μmol/L硫酸锌;C组加入200μmol/L硫酸锌;D组作为空白对照.培养48h后提取细胞RNA,RT-PCR分析成骨细胞骨保护素(OPG)mRNA表达,Elisa检测细胞培养上清中骨保护素表达水平.MTT法测定成骨细胞增殖率.结果 A组、B组、C组与D组细胞骨保护素基因表达比值分别为0.461 +0.051、1.068±0.123、0.244±0.044、0.548±0.089,A组与D组差异不明显,B组高于D组(P＜0.01),C组低于D组(P＜0.01).Elisa结果与RT-PCR相同.细胞增殖率之间差异有显著性意义,B组高于D组(P＜0.01),C组低于D组(P＜0.0l).结论 50μmol/L的锌促进成骨细胞骨保护素基因表达和细胞增殖,200μmol/L的锌则抑制成骨细胞骨保护素基因表达和细胞增殖.而10μmol/L的锌对成骨细胞骨保护素基因表达和细胞增殖的影响不大.     

强骨宝方载药血清灭活与否对成骨细胞增殖功能的影响

目的：探讨强骨宝方糖尿病鼠血清灭活与否对成骨细胞增殖的影响。方法：采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1-2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出成骨细胞，倒置显微镜下观察其形态，碱性磷酸酶（ALPase）染色法、钙化结节染色、Van—Gieson染色鉴定细胞后用灭活和不灭活的不同时效（灌胃3、5d，末次灌胃l、3h）、不同浓度（5％、10％、20％）的强骨宝方糖尿病模型鼠血清加入成骨细胞培养体系，作用一定的时间，应用MTT比色法检测载药血清灭活对成骨细胞增殖能力的影响。结果：强骨宝方灌胃3、5d，末次灌胃l、3h的5％、10％、20％糖尿病鼠不灭活血清与灭活组相比差异有统计学意义，以不灭活载药血清对成骨细胞增殖功能的促进作用较强（P〈0．01或P〈0．05）。结论：强骨宝方糖尿病模型鼠血清灭活与否影响成骨细胞的增殖功能，以不灭活载药血清的作用最佳。     

淫羊藿苷对人成骨细胞增殖及OPG蛋白表达的实验研究

目的：建立体外培养人成骨细胞系,观察淫羊藿苷对人成骨细胞增殖的影响,以及对人成骨细胞内骨保护素（Osteoprorotegerin,OPG）蛋白表达的影响,探讨淫羊藿苷促进人成骨细胞骨形成的可能作用机制。方法：将手术中取得的人股骨头松质骨骨片,使用酶消化法进行培养,取生长良好的第3代人成骨细胞进行实验。实验分为4组,对照组给予15%NCS-DMEM-F12（1：1）培养液培养;淫羊藿苷组分别于正常培养液内添加终浓度为10-6、10-8、10-10mol/L淫羊藿苷。噻唑蓝比色法（MTT）分别在培养1、3、5、7、9d后观察各组人成骨细胞的增殖情况,用蛋白免疫印迹方法（in-cell western blot）测定各组培养8、10、12d后人成骨细胞内OPG蛋白的表达情况。采用重复测量的方差分析方法,比较各组间在不同时间点的作用差异。结果：MTT结果,淫羊藿苷组具有促进人成骨细胞增殖的作用,并呈明显的量效关系,即随着淫羊藿苷浓度的增高,其促人成骨细胞增殖的能力增强,以10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）促成骨细胞增殖的作用最显著,与对照组（0.268±0.031）比较差异有统计学意义（P〈0.05）。在时效关系的研究中,随着培养天数的延长,人成骨细胞的量逐渐增加,人成骨细胞于第5天时进入快速生长期,第7天进入平台期;淫羊藿苷组从第5天开始促进人成骨细胞的增殖,第7、9天仍然具有明显的促成骨细胞增殖的作用,以第9天促增殖作用最强。其中,第9天10-6mol/L淫羊藿苷组（0.402±0.033）与对照组（0.268±0.031）比较有统计学意义（P〈0.01）。OPG表达结果,对照组人成骨细胞培养至第8天时检测到OPG蛋白的表达,表达量为1.01±0.08,第12天达到表达高峰为1.80±0.10,两个值比较有统计学差异（P〈0.05）;在观察的不同天数内,不同浓度的淫羊藿苷组人成骨细胞内OPG蛋白表达低于对照组,且随着淫羊藿苷浓度的降低,OPG蛋白的表达量逐渐降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;干预12d,10-6mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.67±0.13）和10-8mol/L淫羊藿苷组OPG量（1.64±0.05）比较,无统计学差异（P〉0.05）。结论：淫羊藿苷促人成骨细胞骨形成能力的作用途径之一,是通过提高人成骨细胞的增殖能力而实现。