神经酰胺对人内皮细胞凋亡及bax、bcl-2表达的影响

目的 观察外源性神经酰胺(C2-ceramide)对内皮细胞凋亡及相关基因bax和bcl-2表达变化的影响.方法 原代培养人脐静脉血管内皮细胞,加药组加入终浓度分别为5、12.5、25、50 μmol/L的C2-ceramide,对照组加入体积分数为0.1%的无水乙醇.采用TUNEL法检测细胞凋亡,用RT-PCR、Western blot技术对bax mRNA、bcl-2 mRNA及蛋白表达进行分析.结果 加药组内皮细胞的凋亡阳性率显著高于对照组(P＜0.05),且具有时间和剂量依赖性;加药组bax mRNA及蛋白的表达较对照组显著升高(P＜0.05),bcl-2 mRNA及蛋白的表达较对照组则显著降低(P＜0.05).结论 外源性神经酰胺通过上调bax及下调bcl-2表达水平,改变bax/bcl-2值,从而诱导内皮细胞凋亡.     

血管紧张素Ⅱ通过上调富含半胱氨酸蛋白61表达诱导HEK293T细胞凋亡

目的探讨富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导HEK293 细胞功能中的改变及作用。方法 HEK293T细胞于体外培养,并应用CRISPR/Cas9技术敲低HEK293T细胞Cyr61基因。将细胞分为四组：（1）对照组;（2）Cyr61 敲低组;（3）AngⅡ组;（4）AngⅡ+Cyr61敲低组,以10-7 mol/L AngⅡ处理细胞,48 h收集细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡,通过 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术及蛋白质免疫印迹技术检测细胞Cyr61及Bcl-2的mRNA及蛋白表达量。结果Cyr61敲低 组Cyr61蛋白水平较正常对照组明显下降（P<0.05）,AngⅡ干预48 h 后Cyr61蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Bcl-2 蛋白和mRNA表达水平明显下降（P<0.05）,敲低Cyr61 后Bcl-2 蛋白和mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,与对照组凋亡率 （11.88±1.46）%相比,Cyr61敲低组凋亡率为（3.87±0. 83）%,AngⅡ干预组HEK293T细胞凋亡率为（26.94±3.73）%（P<0.05）,与 AngⅡ干预组相比,Cyr61 敲低+AngⅡ组凋亡率为（15.76±1.31）%（P<0.05）。结论Cyr61 表达量的上调与AngⅡ诱导的 HEK293T细胞损伤有关,下调Cyr61的表达可以有效地保护AngⅡ诱导的细胞损伤。     

血管紧张素Ⅱ调控bax、bcl-2 mRNA表达诱导血管内皮细胞凋亡

目的研究血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导细胞凋亡的机制。方法健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代，用不同浓度AngⅡ作用18h，用TUNEL和ELISA检测AngⅡ能否诱导细胞凋亡及其量效关系；用RT—PCR检测bax和bcl-2的mRNA表达。结果．AngⅡ与2型血管紧张素Ⅱ受体（AT2）激动剂CGP42112A一样可以诱导血管内皮细胞凋亡；并且凋亡强度与AngⅡ是典型的剂量依赖关系。在AngⅡ与CGP4211A作用18h后，bax mRNA显著增加，bcl-2 mRNA显著减少。结论AngⅡ通过在转录水平调节bax和bcl-2 mRNA的表达，从而诱导血管内皮细胞凋亡。     

凋亡抵抗在人肺腺癌SPC-A1／多西紫杉醇细胞系耐药机制中的作用

目的:比较人肺腺癌细胞SPC-A1与耐多西紫杉醇细胞系SPC-A1/多西紫杉醇(Docetaxel)经多西紫杉醇诱导后凋亡的差异,研究抗凋亡机制在肺腺癌多西紫杉醇耐药中的作用。方法:以AnnexinV/PI双染法检测SPC-A1/Docetaxel细胞与SPC-A1细胞经不同浓度多西紫杉醇诱导后的凋亡率,免疫组化法及RT-PCR法分别检测SPC-A1/Docetaxel细胞与SPC-A1细胞bcl-2、bax在蛋白和mRNA水平的表达。结果:SPC-A1/Docetaxel细胞与SPC-A1细胞的自然凋亡率分别为(7.5±1.1)%和(4.7±0.7)%;经5、10和20μg/L的多西紫杉醇作用48 h后,SPC-A1/Docetaxel细胞的凋亡率分别为(7.8±2.1)%、(11.3±3.1)%和(25.6±4.5)%,SPC-A1细胞的凋亡率分别为(23.7±4.5)%、(44.2±5.0)%和(40.9±2.8)%;各组SPC-A1/Docetaxel细胞的早期凋亡率均显著低于SPC-A1细胞(P<0.05)。免疫组化结果显示,SPC-A1/Docetaxel细胞中bcl-2蛋白表达较SPC-A1细胞明显升高(P<0.05),而bax蛋白表达明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与SPC-A1细胞相比,SPC-A1/Docetaxel细胞的bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05),而bax mRNA表达降低(P<0.05)。结论:抗凋亡是肺腺癌SPC-A1/Docetaxel细胞多药耐药的机制之一,且与抗凋亡因子bcl-2表达上调和促凋亡因子bax表达下调相关。     

P21/Wafl调节血管紧张素Ⅱ的抗增生作用

为了研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的抗内皮细胞增生作用及其分子生物学调节机制,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用AngⅡ培养并在不同时间计数细胞密度.用TUNEL或ELISA方法证明AngⅡ或CGP42112A诱导内皮细胞凋亡.用RT-PCR和Western Blot检测p21/waf1 mRNA和P21蛋白的表达并测定条带的光密度.结果表明,在Ang I培养后不同时间,细胞密度比对照减少30%左右(P＜0.01).AngⅡ作用后可以诱导典型的凋亡,阳性率极显著高于阴性对照组并具有剂量依赖性.AngⅡ组或CGP42112A组的p21/waf1 mRNA表达分别是对照组的(473.69±39.97)%和(391.58±48.24)%(P＜0.01).Ang Ⅱ组的P21蛋白表达比对照组极显著地增加并具有时间依赖性.认为Ang I具有抗内皮细胞增生作用,其细胞内机制是同时诱导凋亡和p21/waf1 mRNA与p21蛋白的高表达,使细胞发生G1期阻滞,增殖受抑.     

Ghrelin对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 观察促生长激素释放肽Ghrelin对血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 凋亡的影响.方法 将体外培养的HUVECs随机分为6组:正常对照组、Ghrelin组、AngⅡ组、AngⅡ+Ghrelin不同浓度组(Ghrelin 10-8、10-7、10-6mol/L3个浓度组),每组6个复孔,分别用AngⅡ及Ghrelin干预18 h后,采用噻唑蓝比色法(MTT)检测HUVECs的活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 与正常对照组比较,AngⅡ组HUVECs存活率显著降低(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.01);Ghrelin呈浓度依赖性抑制AngⅡ诱导的细胞存活率下降及促细胞凋亡;单用Ghrelin对HUVECs无明显影响.结论 Ghrelin可抑制AngⅡ诱导HUVECs 凋亡作用,对内皮细胞具有保护作用.     

血管紧张素Ⅱ对内皮细胞致凋亡效应及血脂康的保护作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖与凋亡的影响及血脂康对AngⅡ此效应的干预作用,探讨AngⅡ的致动脉粥样硬化作用及血脂康调脂之外的内皮保护作用。方法将体外培养内皮细胞株ECV304进行实验分组:空白对照组;AngⅡ诱导组,培养基中AngⅡ终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L,与细胞共孵育18h。利用三磷酸腺苷生物素发光法(ATP法)检测AngⅡ对HU VECs生长增殖的影响,用电子显微镜观察AngⅡ(10-4mol/L)诱导后内皮细胞的超微结构特点,用流式细胞仪检测AngⅡ作用后内皮细胞凋亡率的变化,采用比色法检验AngⅡ(10-4mol/L)诱导后内皮细胞Caspase3活性的改变;血脂康干预组,培养基中AngⅡ浓度为10-4mol/L,同时加入血脂康500ng/ml与细胞共培养18h,检测该组内皮细胞凋亡率和Caspase3活性的变化。结果与对照组比较,不同浓度(10-8～10-4mol/L)的AngⅡ均能抑制内皮细胞生长增殖(P<0.05),且其作用呈剂量依赖性;不同浓度(10-7～10-4mol/L)的AngⅡ均可显著诱导内皮细胞凋亡(P<0.05),同时Caspase3的活性在AngⅡ(10-4mol/L)作用后明显增加(P<0.01);透射电镜下可见AngⅡ诱导后内皮细胞呈明显凋亡改变;血脂康(500ng/ml)可抑制AngⅡ(10-4mol/L)所诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05)。结论     

缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化

目的:研究缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化. 方法:通过胶原酶/胰酶联合消化法获取成人肥大心肌细胞,采用缺氧-复氧诱导细胞凋亡,改良TUNEL法检测细胞凋亡率,并用免疫细胞化学法检测bcl-2、bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白的变化,用原位杂交法检测bcl-2 mRNA、caspase3 mRNA和Akt1 mRNA表达的变化. 结果:缺氧24 h-复氧4 h后细胞凋亡率为(17.50±0.67)%,对照组为(2.88±0.27)%;凋亡信号的平均吸光度(A)值:bcl-2为0.189±0.006,对照组为0.238±0.004;bax为0.240±0.002,对照组为0.218±0.004;caspase-3为0.230±0.002,对照组为0.202±0.004;细胞色素C为0.225±0.003,对照组为0.191±0.009;磷酸酪氨酸蛋白为0.186±0.005,对照组为0.154±0.003;bcl-2 mRNA为0.300±0.003,对照组为0.360±0.001;caspase 3 mRNA为0.307±0.004,对照组为0.271±0.002;Akt1 mRNA为0.274±0.007,对照组为0.301±0.008,差异均有统计学意义(P<0.01). 结论:缺氧-复氧可造成人肥大心肌细胞凋亡,bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA和Akt1 mRNA表达降低,bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白及caspase3 mRNA表达增加.     

血管紧张素Ⅱ诱导人内皮细胞凋亡

为探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能否诱导人内皮细胞凋亡,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用不同浓度AngⅡ培养不同时间,用TUNEL和ELISA检测细胞凋亡,并检验Caspase-3酶活性变化.用RT-PCR检测AngⅡ受体AT1和AT2的mRNA表达.发现AngⅡ可以诱导出典型的凋亡,凋亡细胞阳性率极显著高于对照组,凋亡强度与AngⅡ呈现剂量依赖关系.Caspase-3酶活性在AngⅡ作用后有极显著的增加.内皮细胞同时表达AT1和AT2的mR-NA.结果表明AngⅡ经AT1或(和)AT2可以诱导人内皮细胞凋亡,并且是Caspase-3依赖性的.这一结果有助于阐明AngⅡ的致病机制.     

血管紧张素Ⅱ调控bax mRNA表达诱导内皮细胞凋亡

目的　研究AngⅡ诱导凋亡细胞内机制。方法　健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第三代,用不同浓度AngⅡ作用不同时间,用TUNEL和ELISA检测AngⅡ能否诱导凋亡及有否剂量依赖性;用RT—PCR检测bax的mRNA表达。结果　AngⅡ同AT2 受体激动剂CGP42 1 1 2A一样可以诱导内皮细胞凋亡;并且凋亡强度与AngⅡ成典型的剂量依赖关系。在AngⅡ与CGP42 1 1A作用1 8小时后,baxmRNA显著增加。结论　AngⅡ在转录水平上诱导baxmRNA高表达,使得Bax蛋白高表达,致Bax Bcl- 2比值极显著地增加,细胞内促凋亡因素占优势地位而诱发凋亡。     

DPI抑制血管紧张素Ⅱ介导的内皮细胞凋亡和NOX4表达

目的观察DPI对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的内皮细胞凋亡和NOX4表达的影响。方法倒置显微镜下观察人脐静脉内皮细胞形态；实验设对照组、AngⅡ组（10^-7mol／L AngⅡ处理16h）和DPI干预纽（10^-7mol／L AngⅡ加10μmol／L DPI处理16h）；用RT-PCR检测NOX4 mRNA水平；Hoechest染色观察细胞凋亡。结果AngⅡ组细胞凋亡与对照组相比明显增多，而DPI干预组细胞无明显改变；AngⅡ组hUVECs中NOX4 mRNA表达上调与对照组相比差异有显著性；而DPI干预组hUVECs中NOX4 mRNA表达与对照组相比差异无显著性，DPI干预组hUVECs中NOX4 mRNA表达与AngⅡ组相比差异有显著性。结论DPI抑制AngⅡ介导的内皮细胞凋亡和NOX mRNA表达。     

血管紧张素Ⅱ对培养的人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响

目的:研究血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响.方法:采用体外培养人近端肾小管上皮细胞株(HPTC),分别观察不同浓度(0、10-9、10-7、10-5mol*L-1)Ang Ⅱ处理48 h,或用Ang Ⅱ(浓度为10-7mol*L-1)处理不同时间(0、12、24、48、72 h)对HPTC结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达的影响,CTGF mRNA表达采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定.结果:Ang Ⅱ(10-7mol*L-1)作用于HPTC 12 h后,细胞CTGF mRNA的表达开始增加,72 h达最高水平,与对照组相比,Ang Ⅱ作用48 h后显著增加[(0.097±0.015)vs(0.632±0.041),P<0.01];无Ang Ⅱ的DMEM培养HPTC,72 h内细胞CTGF mRNA水平未见明显改变(P>0.05).不同浓度(10-9、10-7、10-5mol*L-1)Ang Ⅱ作用于HPTC 48 h,CTGF mRNA的表达均有增加,分别是对照组(0 mol*L-1)的1.5、5.5和7.4倍(P<0.01),对扩增产物进行测序证实与基因库中人CTGF的cDNA序列一致.结论:Ang Ⅱ呈时间和剂量依赖性地刺激HPTC CTGF mRNA表达,此结果提示Ang Ⅱ可能通过促进CTGF表达而参与小管间质纤维化的发生.     

HO-1对AngⅡ诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的作用

目的 探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的作用.方法 原代培养1～2 d Wistar乳鼠心肌细胞,随机分为对照组、AngⅡ组(加入AngⅡ)、HO-1诱导组(加入AngⅡ和HO-1 诱导剂氯化血红素hemin)和HO-1抑制组(加入AngⅡ和HO-1抑制剂锌原卟啉-9 ZnppIX).采用Western blotting检测心肌细胞HO-1蛋白的表达,Hoechst及流式细胞仪Annexin-V/PI检测细胞凋亡.结果 AngⅡ组较对照组心肌细胞凋亡率明显升高(P ＜0.05);HO-1诱导组较AngⅡ组细胞凋亡率明显下降(P＜0.05),HO-1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);而HO-1抑制组较AngⅡ组心肌细胞凋亡率及HO-1蛋白表达水平均无明显变化(P＞0.05).结论 HO-1对AngⅡ诱导的乳鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用.     

血管紧张素Ⅱ诱导人内皮细胞凋亡

为探讨血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）能否诱导人内皮细胞凋亡,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用不同浓度Ang Ⅱ培养不同时间,用TUNEL和ELISA检测细胞凋亡,并检验Caspase-3酶性变化,用RT－PCR检测Ang Ⅱ受体AT1和AT2的mRNA表达。发现Ang Ⅱ可以诱导出典型的凋亡,凋亡细胞阳性率极显著高于对照组,凋亡强度与Ang Ⅱ呈现剂量依赖关系。Caspase-3酶活性在Ang Ⅱ作用后有极显著的增加。内皮细胞同时表达AT1和AT2的mRNA。结果表明：Ang Ⅱ经AT1或（和）AT2可以诱导人内皮细胞凋亡,并且是Caspase-3依赖性的。这一结果有助于阐明Ang Ⅱ的致病机制。     

血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞凋亡

目的:观察血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AⅡ)对心肌细胞凋亡的诱导作用及其作用受体.方法:体外培养的Wistar乳鼠心肌细胞,以AⅡ10-11～10-5 mol*L-1孵育24 h,采用流式细胞术及TUNEL方法检测凋亡细胞;然后加入AⅡⅠ型受体阻断剂氯沙坦与AⅡ共同孵育,观察其对AⅡ诱导的心肌细胞凋亡的影响.结果: AⅡ 10-11 mol*L-1组凋亡细胞数量与对照组差异无显著性[(14.63±3.18)% vs (10.55±2.67)%, P>0.05]; AⅡ10-9 mol*L-1组凋亡心肌细胞数量显著高于对照组[(22.18±3.59)% vs (10.55±2.67)%, P<0.01]; AⅡ浓度为10-9 mol*L-1、10-7 mol*L-1和10-5 mol*L-1三组间,凋亡细胞数量差异无显著性[(22.18±3.59)%, (19.07±3.27)%, (25.06±5.64)%,P>0.05].氯沙坦抑制AⅡ诱导的心肌细胞凋亡[(12.87±4.31)% vs(19.07±3.27)%,P<0.05].TUNEL染色支持以上结果.结论:血管紧张素Ⅱ可以诱导乳鼠心肌细胞凋亡,其作用可能通过AⅡⅠ型受体介导.     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的:探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165)共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法:应用复制缺陷型腺病毒(Ad)-绿色荧光蛋白(GFP)、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果:MTT结果显示24、48和72 h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05);Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05);Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05);bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论:Ang1、VEGF165和Ang1 VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1 VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

西红花苷对3β,5α,6β-三羟胆甾烷致内皮细胞凋亡和相关基因表达的影响

目的:研究西红花苷(crocin)对3β,5α,6β-三羟胆甾烷(cholestane-3β,5α,6β-triol,Triol)致血管内皮细胞凋亡和相关基因表达的影响.方法:将内皮细胞分成正常对照组、模型组(25 μmol/L Triol)、西红花苷 (10-6 mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L) 25 μmol/L Triol组.采用诱导内皮细胞凋亡的模型,用比色法测定丙二醛含量.光学显微镜、电子显微镜观察细胞形态和超微结构的变化,电泳法检测DNA 梯形条带、流式细胞仪分析法检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax mRNA表达,免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达.结果:用Triol处理后,培养液中MDA含量增加(P<0.01 vs control),细胞收缩,核浓缩,深染,线粒体肿胀空化,出现凋亡小体、DNA 梯形条带和亚二倍体峰,细胞凋亡率为30.62%,Bax mRNA、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组(P<0.01);Bcl-2 mRNA和蛋白表达低于正常对照组(P<0.01);西红花苷(10-7mol/L、10-6mol/L) Triol组,MDA含量减少,内皮细胞形态结构完整,细胞凋亡率分别为24.4%、6.3%,细胞Bax和Caspase-3基因表达明显下调,Bcl-2基因表达上调(P<0.05 or P<0.01 vs Triol).结论:西红花苷可能是通过调节Bcl-2,Bax 和Caspase-3基因表达抑制Triol诱导的内皮细胞凋亡.     

RhoA-ROCK通路在血管紧张素Ⅱ刺激人胚肺成纤维细胞表达结缔组织生长因子中的作用

目的 探讨RhoA-ROCK通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激人胚肺成纤维细胞(HFL-1)表达结缔组织生长因子(CTGF)中的作用.方法 培养HFL-1,设置无刺激对照组、AngⅡ组(10-7 mol/L的AngⅡ刺激)、Irbesartan+AngⅡ组(以10-6 mol/L的AT-1受体拮抗剂Irbesartan预处理1 h后再予10-7 mol/L的AngⅡ刺激)和ROCK抑制剂Y27632+AngⅡ组(10-6 mol/L的Y27632预处理1 h后再予10-7 mol/L的AngⅡ刺激).利用Western印迹和QuantiGene多基因定量方法检测RhoA-ROCK激活及下游因子CTGF表达情况.结果 观察Irbesartan对AngⅡ诱导CTGF蛋白表达的实验,结果:AngⅡ组CTGF蛋白表达较对照组增强(0.89±0.05比0.48±0.10,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(0.72±0.05)较AngⅡ组减弱(P＜0.05).AngⅡ组RhoA蛋白表达较对照组增强(3.40±0.46比1.77±0.37,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(2.27±0.45)较AngⅡ组减弱(P＜0.05).重新培养细胞留取标本观察Y27632对AngⅡ诱导CTGF蛋白表达的影响,结果:AngⅡ组CTGF蛋白表达较对照组增强(0.62±0.15比0.16±0.05,P＜0.01),Y27632+AngⅡ组(0.17±0.04)较AngⅡ组减弱(P＜0.01).从基因水平重复上述实验,结果:AngⅡ组CTGF mRNA表达较对照组增强(1.16±0.06比1.00±0.01,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(0.99±0.07)较AngⅡ组减弱(P＜0.01),Y27632+AngⅡ组(1.04±0.08)较AngⅡ组减弱(P＜0.05);AngⅡ组RhoA mRNA表达较对照组增强(1.21±0.07比1.00±0.06,P＜0.01),Irbesartan+AngⅡ组(1.00±0.12)较AngⅡ组减弱(P＜0.05),Y27632+AngⅡ组(1.10±0.05)与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AngⅡ通过AT-1受体诱导HFL-1细胞CTGF蛋白和mRNA表达,RhoA-Rock通路参与其中.

Abstract：

Objective To explore the production of connective tissue growth factor(CTGF)by Angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ)in human embryonic lung fibroblast via the RhoA-ROCK pathway. Methods Human embryonic lung fibroblast(HFL-1)was divided into 4 groups:(1)control group:no stimulation;(2)AngⅡgroup:stimulation of AngⅡ(10-7 mol/L);(3)Irbesartan plus Ang Ⅱ group:stimulation by Ang Ⅱ(10-7 mol/L)with AT-1 receptor antagonist irbesartan(10-6 mol/L)pre-treatment;(4)Irbesartan plus Ang Ⅱ group:stimulation by Ang Ⅱ(10-7 mol/L)with ROCK inhibitor Y27632(10-6 mol/L)pretreatment.Then the products of protein and RNA were collected.Western blot and QuantiGene were used to detect the activation of RhoA-Rock pathway and CTGF.Results Exploring the affect of irbesartan on Ang Ⅱ through the Western blot analysis of CTGF and RhoA protein expression:the CTGF level was up-regulated by AngⅡ(0.89±0.05 vs control 0.48 ±0.10,P ＜0.01).Such an effect was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(0.72 ± 0.05,P＜0.05).After the use of Ang Ⅱ,the expression of RhoA protein was significantly enhanced(3.40 ± 0.46 vs control 1.77 ± 0.37,P＜0.01)and blunted by a pretreatment of irbesartan(2.27 ± 0.45,P＜0.05).The Western blot analysis of CTGF protein expression showed that Ang Ⅱ caused a robust increase in CTGF(0.62 ± 0.15 vs control 0.16 ± 0.05,P＜0.01).Such an effect was markedly blocked by a pretreatment of Y27632(0.17 ± 0.04,P＜0.01).The result was similar at the gene level.Ang Ⅱ significantly increased the expression of CTGF mRNA(1.16 ± 0.06 vs control 1.00 ± 0.01,P＜0.01).And it was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(0.99 ±0.07,P＜0.01)or Y27632(1.04 ±0.08,P＜0.05).AngⅡ significantly increased the expression of RhoA mRNA(1.21 ± 0.07 vs control 1.00 ± 0.06,P＜0.01).And it was markedly blocked by a pretreatment of irbesartan(1.00 ± 0.12,P＜0.05)but not Y27632(1.10 ± 0.05,P＞0.05).Conclusion Ang Ⅱ activates HFL-1 to produce CTGF through the AT-1 receptor.And the RhoA-Rock pathway is involved.     

异丙酚抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖的机制研究

目的 探讨异丙酚抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞增殖的机制.方法 使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中含有1％(w/v)胰蛋白酶、0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.1％胶原酶的酶混合物,将切碎的心室心肌连续消化,将分离的细胞混合物在培养箱中预铺板1 h,以分离成纤维细胞.将培养细胞分为对照组、诱导组、异丙酚处理组和抑制剂组.通过5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入测定法检测细胞增殖;通过使用WST-1测定法测量细胞活力;通过发光素增强化学发光法测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和活性氧(ROS)活性;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化和激活蛋白-1(AP-1)、内皮素-1(ET-1)mRNA相对表达水平;Western blot分析蛋白激酶B(Akt)、一氧化氮合酶(eNOS)的表达.结果 第24、72小时,诱导组较对照组细胞增殖能力增强,异丙酚处理组较诱导组减弱(P<0.05).与对照组比较,诱导组细胞凋亡率降低,细胞活力升高;与诱导组比较,异丙酚处理组细胞凋亡率升高,细胞活力降低(P<0.05).诱导组NADPH、ROS活性较对照组升高,异丙酚处理组较诱导组降低(P<0.05).诱导组ERK、AP-1和ET-1 mRNA相对表达水平较对照组升高,异丙酚处理组较诱导组降低(P<0.05).异丙酚处理组Akt、eNOS表达水平较诱导组降低,抑制剂组较异丙酚处理组升高(P<0.05).结论 异丙酚可通过干扰ROS的生成来抑制AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖.     

AngⅡ对人脐静脉内皮细胞CGRP受体组分的调节差异

目的 探讨血管紧张素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中降钙素基因相关肽(CGRP)受体组分的影响。方法以HUVECs作为实验对象,用无血清培养基同步化24 h后,以Ang Ⅱ非处理细胞为对照组,AngⅡ处理组为不同剂量的AngⅡ处理HUVECs 12 h,流式细胞仪检测细胞增殖率和凋亡率。Western Blot检测CGRP三种受体组分,即降钙素受体样受体(CRLR)、降钙素受体组分蛋白(RCP)和受体修饰蛋白(RAMP)1的蛋白表达。结果与对照组相比,在处理组细胞,AngⅡ呈剂量依赖性地抑制HUVECs增殖和诱导细胞凋亡,同时上调CRLR表达(P<0.01)。而对另外两个受体蛋白而言,AngⅡ(0.01～100 nmol/L)呈剂量依赖性的下调HUVECs的RAMP1的表达和RCP表达(P<0.05)。结论AngⅡ影响人脐静脉内皮细胞CGRP受体组分的表达存在差异,可引起人脐静脉内皮细胞CGRP受体功能改变。