高钙培养对表皮角质细胞形态和生长特点及角蛋白表达的影响

目的：观察高钙培养后表皮角质细胞的形态、生长特点及角蛋白表达的变化,进一步探讨钙在促进表皮角质细胞分化过程中的重要作用。方法：表皮角质细胞分别在低钙（0.05mmol/L）和高钙（1.2mmol/L）环境条件下培养1-2d,光镜下观察细胞的形态和生长特点,并采用免疫组织化学方法检测表皮角质细胞中角蛋白10（K10）、K14和K19的表达水平。结果：低钙培养的表皮角质细胞散在生长,分布均匀,细胞间隙较大,胞膜圆滑,边界清楚。高钙培养后,细胞胞体变得扁平,细胞间隙消失,并且细胞出现明显的成簇生长趋势。在正常培养即低钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例较少,所培养的细胞几乎全为K14阳性细胞;在高钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例明显增加,而K14的表达没有明显变化。结论：高钙培养能改变表皮角质细胞的形态和生长特点并提高细胞内角蛋白的表达水平,从而促进表皮角质细胞的分化成熟。     

高钙培养促进人表皮角质细胞间的黏附和聚集

目的观察细胞外钙浓度变化对表皮角质细胞黏附聚集的影响，并探讨其可能的调控机制。方法本实验分为两组：低钙培养组（60μmol／L）；高钙（2mmol／L）培养组。培养3d后，镜下观察细胞的黏附和聚集现象；然后利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法测定E-钙调素和P-钙调素mRNA的表达水平；最后借助免疫荧光法检测E-钙调素和P-钙调素蛋白在细胞内的表达和分布。结果高钙培养3d后细胞分层并出现明显的黏附和聚集，E-钙调素也在高钙培养的条件下表达明显增加（P〈0．01），而P-钙调素的表达没有明显的变化。结论高钙培养促进人表皮角质细胞的黏附和聚集，E-钙调素的表达可能在其中发挥重要作用。     

血竭提取物对角质形成细胞增殖的影响

目的:观察血竭提取物对体外培养角质形成细胞增殖的影响,探讨血竭促进创面愈合的机制。方法:将血竭经过氯仿、乙酸乙酯、乙醇回流提取得到三种提取液,进行角质形成细胞的培养,噻唑蓝(MTT)法检测不同血竭提取物在不同浓度以及不同时间点对体外培养角质形成细胞增殖的影响,并绘制最适浓度下细胞生长曲线。利用流式细胞仪分析最适浓度培养条件下角质形成细胞的细胞周期变化。结果:血竭乙酸乙酯提取物在0.0625～0.5mg/ml浓度范围内,促进角质形成细胞增殖,且呈剂量依赖性,在0.5mg/ml浓度值时促进作用最显著,此条件下细胞DNA合成S期较对照组增加25.7%(P<0.01)。结论:血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进角质形成细胞增殖作用,提示血竭可能具有促进创面愈合中再上皮化的作用。     

人表皮角质细胞系培养过程中细胞生物学行为和表型的变化

目的:获得较高比例的已分化表皮细胞,为表皮细胞去分化研究奠定基础.方法:采用常规表皮细胞培养方法对人表皮角质细胞系(HEK)进行培养和传代.每一代细胞均通过免疫细胞化学染色和Western blot 方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物的检测,包括β1整合素、角蛋白19(K19)、角蛋白10(K10)等指标.结果:第1代HEK呈克隆样生长,表皮干细胞标志物β1整合素、K19均有高表达,而K10的表达为阴性.经过数次传代,细胞克隆形成数目减少,细胞逐渐呈分散分布,K10的表达逐渐增高,而β1整合素、K19的表达呈下降趋势,比例减少.细胞培养至第5～6代时,为其生长的一个转折点,即此时细胞增殖能力开始明显降低,但形态良好,K10表达阳性细胞比例明显增高,而β1整合素、K19表达阳性细胞比例迅速降低.细胞培养至10～11代时,为其生长的第二个转折点,此时细胞几乎丧失增殖能力,数量显著减少,体积变大,核浆比明显减小,完全见不到β1整合素、K19表达阳性细胞,K10染色均为阳性.结论:可以选取适当代数的HEK用于去分化研究,为增加HEK的新用途提供了实验基础.     

芦荟多糖对体外培养人表皮细胞增殖的影响

目的观察芦荟多糖(AP)对体外培养人表皮细胞增殖的影响。方法体外培养人表皮细胞,依据所用DK-SFM培养液中AP含量的不同,将细胞随机分为25、50、100、200和400mg/LAP组,对照组细胞仅加入等体积的DK-SFM培养液。通过倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构,并计算细胞融合时间。应用噻唑蓝法、氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法、细胞计数法和流式细胞技术分别观察细胞存活率、3H-TdR掺入量、生长曲线分布情况及细胞周期,用以反映细胞增殖状况;通过检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率反映细胞损伤程度。结果倒置相差显微镜观察到,各组表皮细胞形态基本相似;透射电镜下观察到,100、400mg/L AP组细胞增殖活跃,核内以常染色质为主,而对照组和25mg/L AP组细胞则以异染色质为主。50~400mg/L AP组细胞融合时间分别为(154±12)、(141±20)、(130±19)、(124±13)h,明显早于对照组(182±8)h(P<0·01).从生长曲线上可见,100~400mg/LAP组细胞增殖达峰值的时间较其他组提前1~2d;25~400mg/LAP组细胞存活率、3H-TdR掺入量均高于对照组。与对照组比较,25~400mg/L AP组G0/G1期细胞所占百分比明显减少,G2/M期和S期细胞则明显增加(P<0.01).200、400mg/L AP组细胞LDH漏出率低于对照组及25、50mg/L AP组(P<0.01).结论高剂量AP对表皮细胞有保护效能,它通过诱导表皮细胞从G0/G1期进入G2/M期和S期促进细胞增殖。     

纤维连接蛋白调理的人表皮角质细胞粘附、迁移功能

目的观察纤维连接蛋白(FN)对人表皮角质细胞(EKC)在体外培养过程中有无粘附、迁移作用.方法利用不同剂量的FN,对新鲜EKC及体外培养7～10d的EKC进行粘附、迁移功能测定.应用间接免疫荧光染色法,检测α5β1受体在细胞培养前后的表达.结果(1)新鲜EKC在FN调理下的粘附、迁移值明显低于体外培养7～10d的EKC,粘附值分别为(0.9±0.5)%、(37.26±8.34)%(P＜0.01),迁移指数分别为17.5±2.5、48.7±3.2(P＜0.01).(2)培养1d的EKC及组织块体外培养后增生的表皮细胞,α5β1受体的表达染色阳性;培养7d的EKC及组织块增生表皮外周边缘染色呈强阳性;新鲜EKC染色阴性或弱阳性.结论(1)新鲜EKC与培养7～10d的EKC生物学功能间差异有显著性意义.(2)EKC生物学功能活跃的阶段(培养7d)和部位(组织块边缘增生的表皮细胞)α5β1受体表达最强.(3)体外培养能有效地诱导和激活EKC的粘附、迁移功能,使生物学功能相对静止的EKC变成了功能活跃的EKC细胞.     

缓激肽对人角质形成细胞增殖凋亡及分化影响的实验研究

目的观察缓激肽(BK)对体外培养的人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响并探讨其机制。方法以1×10-4~1×10-9mol/LBK作用于体外培养的HKC,采用噻唑蓝法、台盼蓝染色法观察到1×10-4mol/LBK抑制作用最强,以此浓度BK进行余下实验。当HKC达对数生长期后,一部分加入1×10-4mol/LBK作为实验组,另一部分不加BK作为对照组,分别培养24、48h后采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况及细胞周期,用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白的表达情况。用含1×10-4mol/LBK的无血清培养基KC-SFM培养HKC作为实验组,对照组细胞仅加KC-SFM,分别用激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针Fluo-3/AM技术检测细胞内游离Ca2 浓度即[Ca2 ]i的变化。结果与对照组比较,实验组G0/G1期细胞比例相对上升34.57%,S期相对下降58.91%,其细胞早期凋亡率为15.34%,明显高于对照组(5.60%,P<0.05)。实验组HKCK10阳性细胞百分比为2.20%,明显低于对照组(6.89%,P<0.05)。BK作用3min后实验组HKC[Ca2 ]i较对照组上升163.0%,之后开始下降,5min后接近对照组。结论高浓度BK可抑制HKC周期进程、明显促进其凋亡及诱导[Ca2 ]i升高,这可能是其使HKC体外生长受抑的部分机制。BK还可抑制表皮再生和HKC分化。     

雌激素对人表皮干细胞增殖与迁移影响的体外实验

目的表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)在体内的微环境十分复杂,雌激素可能是主要的参与者。探讨雌激素对体外培养的hESCs增殖与迁移的影响。方法取自愿捐赠的正常人包皮标本,采用密度梯度离心法分离培养hESCs,并传至第2代。流式细胞仪检测第2代hESCs整合素β1、细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)、CK14和CK10抗原表达以鉴定hESCs。取第2代hESCs 2×106个分别用含0.1 nmol/L雌激素的ESCs专用培养基(A组)、含10 nmol/L雌激素受体阻断剂的ESCs专用培养基(B组)以及普通ESCs专用培养基(C组)进行培养;于培养后24 h刮擦生长融合成片的hESCs,制备宽度为100μm的体外单层hESCs损伤模型。于模型制备后24、48、72 h,倒置相差显微镜下观察各组表皮创面愈合情况(即hESCs迁移情况),并计算模型制备后72 h各组创面愈合率;于模型制备后24、48、72、96、120 h,采用MTT法检测hESCs分裂增殖活性。结果原代培养的hESCs贴壁呈单层卵圆形、集落样生长。流式细胞仪检测第2代hESCs的整合素β1、CK19、CK14呈阳性标记,阳性率分别为96.63%、95.47%、94.27%;CK10呈阴性标记,阳性率为1.32%。模型制备后24、48、72 h,各组均可见hESCs迁移越过创缘,其中A组越过创缘的细胞数多于B、C组,C组多于B组;模型制备后72 h,A、B、C组创面愈合率分别为69.00%±0.05%、35.00%±0.05%、48.00%±0.06%,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。模型制备后24、48、72、96和120 h,A组hESCs分裂增殖活性高于B、C组,C组高于B组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论雌激素具有促进hESCs分裂增殖和迁移的作用,并藉此可能参与皮肤诸多的生物学作用。     

角质形成细胞条件培养液对成纤维细胞增殖与胶原分泌影响的研究

目的 探讨正常的角质形成细胞对成纤维细胞生物学行为的影响。方法 组织块法培养成纤维细胞，分别加入12．5％、25％与50％浓度的角质形成细胞条件培养液为实验组，加入不含血清DMEM为对照组，采用MTT、羟脯氨酸比色法测定成纤维细胞增殖、胶原合成；以流式细胞仪测定50％浓度角质形成细胞条件培养液组及对照组成纤维细胞生长周期。结果细胞增殖测定，各实验组吸光度（A）值与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；随浓度增高，A值增加，25％及50％浓度组与12．5％浓度组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；25％及50％浓度组间比较，差异无统计学意义（P〉0．01）。胶原合成测定中，各实验组A值与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．01）；各实验组组间比较，差异无统计学意义（P〉0．01）。细胞周期测定见，50％浓度组可明显促进成纤维细胞通过G1／S及S／G1限制点，S期及G1／M期细胞与对照组相比明显增多，G0／G1期细胞与对照组相比明显减少，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 正常角质形成细胞的上清液可促进成纤维细胞的增殖，但对其胶原分泌影响不明显。     

合成角质细胞生长因子活性短肽促进表皮细胞增殖的实验研究

目的 应用噬菌体随机7肽库筛选角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor,KGF)的关键序列,进行KGF活性短肽的调整和合成,并研究其对表皮细胞增殖的作用。方法 以KGF单克隆抗体为靶,筛选噬菌体随机7肽库,获得KGF的特异性序列,并进行序列调整。用免疫荧光法检测KGF活性短肽的表皮细胞亲和力。用CCK-8法检测KGF活性短肽对表皮细胞增殖的影响。用RT-PCR法和Western-blot法检测表皮细胞上特异性受体KGFR的表达水平。结果筛选噬菌体随机7肽库,获得2个与KGF相似的特异性序列,合成获得2个KGF活性短肽,并纯化至98%纯度,短肽的C端进行氨基化封闭,N端进行罗丹明激光染料标记。免疫荧光检测结果显示,2个KGF活性短肽均能够与表皮细胞相结合。CCK-8检测结果显示,与阴性对照组相比,2个KGF活性短肽能够促进表皮细胞增殖,并呈浓度依赖性。RT-PCR和Western-blot检测结果显示,2个KGF活性短肽组中表皮细胞表达KGFR增强。结论 从噬菌体随机7肽库中筛选到2个KGF的关键序列,合成的2个KGF活性短肽能够与KGFR相结合,并增强KGFR的表达,从而促进表皮细胞增殖,有望应用于促进创面愈合。     

不同浓度骨痹舒片含药血清对体外培养软骨细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度骨痹舒片含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞增殖的影响。方法：获取1月龄兔关节软骨细胞,随机分为空白组（正常兔血清）及骨痹舒片含药血清组,每组再分5%、10%、15%、20%4个浓度,共8组。分别于培养第1、3、5、7、9天用MTT法检测软骨细胞的增殖情况。结果：骨痹舒片含药血清组细胞呈血清浓度依赖型增殖。同一时间点各组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,以20%组最佳;空白血清组中5%、10%组与20%组相比在各时间点差异均有统计学意义（P〈0.05）,15%组与20%组相比在第1、3、5、7天各时间点相比差异无统计学意义（P〉0.05）,在第9天时差异有统计学意义（P〈0.05）,以20%组最佳。20%骨痹舒片含药血清组与20%空白血清组相比,在第1、3、5、7天时差异有统计学意义（P〈0.05）,第9天差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：20%的骨痹舒片含药血清能显著促进软骨细胞的增殖,并将细胞的指数增长期提前至第3天。     

表皮细胞体外增殖与增殖表型细胞含量变化规律的实验研究

目的研究人表皮细胞(humanepidermalcells,hECs)体外扩增与增殖表型细胞含量变化规律。方法收集2～3岁健康幼儿包皮共20例,对标本拍照,软件分析照片中标本面积,分离、收集表皮细胞,计算原代(P0)细胞获得率(5例)。记录不同代次细胞生长曲线,细胞直径,克隆形成率(5例)。对不同代次细胞的角蛋白19(keratin,K19)和外皮蛋白(involucrin)的mRNA表达情况及阳性细胞率分别进行RTPCR检测(5例)和流式细胞仪(FACS)分析(5例)。结果原代细胞平均获得率为(164±0297)×106cm2。hECs最大可扩增(700±37)倍,第5代(P5)的扩增倍数为(243±13)倍。P0克隆形成率为(45±4)%,随传代依次降低,至第5代(P5)时为(9±2)%,至第6代(P6)时消失。RTPCR检测发现K19mRNA在P5及P5之前表达,P6未见表达;Involucrin各代均表达。FACS检测各代hECs中K19阳性细胞百分率逐渐降低,P0时为(6697±314)%,P6为(465±138)%;外皮蛋白表达阳性细胞百分率逐渐增高,P0时为(1165±162)%,P6为(9703±266)%。结论体外扩增至第5代的幼儿包皮来源的表皮细胞,维持着增殖细胞表型,符合组织工程表皮种子细胞的要求。表皮细胞体外扩增能力逐渐降低与增殖表型细胞含量减少有关。     

Photodynamic effects of di-sulphonated aluminium phthalocyanine on human epidermal keratinocytes in vitro

The photosensitizing effects of di-sulphonated aluminium phthalocyanine (AlS₂Pc) on proliferation of normal human epidermal keratinocytes of the established line UP were studied in cultures in 96-well microtitre plates using the MTT-microculture tetrazolium assay as a method of assessing viable cell number. It was found that the cytotoxic effects of AlS₂Pc were dose-dependent. A cooled slow-scan CCD (charge-coupled device) imaging system with computerized image processing was used for fluorescence measurements in cell cultures after administration of 25 μg ml⁻¹ AlS₂Pc. Fluorescence was at a peak at 24 h and this time was therefore considered to be the most appropriate for light sensitization. Treatment with 25 μg ml⁻¹ AlS₂Pc for 24 h followed by exposure to total red light (660–700 nm) energy dose of 0.6 J cm⁻² reduced cell survival by 100%. It seems that the photokilling capacity of AlS₂Pc on keratinocytes is very effective and this may make it particularly suitable for the treatment of surface epithelial tumours.     

培养的正常和瘢痕角质形成细胞上清液对瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 研究培养的正常角质形成细胞、瘢痕角质形成的细胞的上清液对增生性瘢痕成纤维细胞生物活性和胶原合成的影响。方法 采用MTT、^3H-脯氨酸掺入法、Ⅲ型前胶原放免试剂盒测定不同来源、不同浓茺培养的角度形成细胞上清液，对增生性瘢痕成纤细胞增殖和胶原合成的影响。结果 正常角质形成细胞上清液，可抑制瘢痕成纤维细胞增殖，对细胞内胶原合成有一定的促进作用，但却抑制细胞内胶原向细胞外分泌。瘢痕角质形成细胞上清液，对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用不明显，甚至还有促进的趋势，对细胞内外胶原合成、分泌皆有明显的促进作用。结论 正常角质形成细胞与瘢痕角质形成细胞分泌的物质对瘢痕成纤维细胞具有不同作用。     

釉基质蛋白对人角质形成细胞粘附、增殖及迁移影响的体外研究

目的：观察釉基质蛋白对体外培养的人角质形成细胞粘附、增殖及迁移等生物功能的影响。方法：消化法培养人正常角质形成细胞，采用MTT比色法及体外划痕法，观察人正常角质形成细胞在不同浓度釉基质蛋白（50、100、150及200μg／ml等浓度的 EbtPs）包被的培养孔表面粘附、增殖及迁移情况，试验各组依次命名为EP1、EP2、EP3、EP4组。结果：①细胞粘附性实验中，EP2、EP3及EP4组在接种细胞4．5h后结果均高于空白对照组（P〈0．05）；②细胞增殖实验中，在各时间点各组之间无统计学差异（P〉00．05）；③细胞迁移实验中，各实验组和空白对照组间并无统计学差异（P〉0．05）。结论：EbtP对人正常角质形成细胞粘附有促进作用，而对其增殖和迁移则没有影响。     

Effects of granulation-tissue-conditioned medium on the growth of human keratinocytes in-vitro

Human keratinocyte cultures were seeded and grown for 24 hours in the presence of medium conditioned by exposure to granulation tissue and to normal tissue. The effects on cell proliferation were investigated by measurement of [3H]thymidine incorporation into cellular DNA. Keratinocyte growth was found to be markedly inhibited in the presence of granulation-tissue-conditioned medium (p much less than 0.05). Possible factors responsible for the inhibition have been investigated and the observations suggest that fibrin, or products derived from fibrin/fibrinogen may play a role in the suppression of cell growth.     

Effects of TGF-β1 and IGF-1 on proliferation of human nucleus pulposus cells in medium with different serum concentrations

Background  

The low proliferative viability of human nucleus pulposus(NP) cells is considered as a cause of intervertebral discs degeneration. Growth factors, such as TGF-β1 and IGF-1, have been implicated in cell proliferation and matrix synthesis.     

In vitro toxicity of photodynamic antimicrobial chemotherapy on human keratinocytes proliferation

This in vitro experimental study has been designed to assess the effects of photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) on human keratinocytes proliferation. Human keratinocytes (HaCaT) monolayers (～0.5 cm²) have been irradiated with 635 nm red laser light with a fluence of 82.5 or 112.5 J/cm² in the absence or presence of toluidine (TB). Cell proliferation, monolayer area coverage, cytokeratin 5 (K5) and filaggrin (Fil) expression, and metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 activity were measured after 72 h from laser irradiation. HaCaT proliferation was reduced by TB staining. Cell exposure to both low- and high-fluence laser irradiation in both presence and absence of TB staining reduced their proliferation and monolayer area extension. Moreover both laser treatments were able to reduce K5 and Fil expression and MMP-9 production in keratinocytes not treated with TB. These data indicate that PACT could exert toxic effects on normal proliferating keratinocytes present around parodontal pockets. The observed reduced cell proliferation along with a reduced production of enzymes involved in wound healing could alter the clinical outcome of the patients treated with PACT.