p44/p42激酶磷酸化在丹参注射液定向诱导成肌细胞分化为神经元样细胞过程中的作用

背景:睫状神经因子通过细胞表面的受体可以使成肌细胞去分化而转变为多能性干细胞,而p44/p42激酶可以进一步激活睫状神经因子下游基因的表达,与细胞去分化密切相关.目的:观察丹参注射液诱导成肌细胞分化成神经元的细胞模型中p42/p44激酶磷酸化的情况.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2008-03/06在辽宁医学院附属第二医院口腔科学实验室完成.材料:清洁级新生1周SD大鼠1只,由辽宁医学院实验动物中心提供.丹参注射液为四川三精升和制药有限公司产品,批号080717.主要成分为丹参.睫状神经营养因子为Sigma产品.方法:体外分离培养大鼠成肌细胞,传至第5代接种于6孔板内,诱导组使用50μg/L睫状神经因子预诱导72 h,再更换含复方丹参注射液的无血清DMEM培养基诱导10 h;对照组使用不含复方丹参注射液的无血清DMEM培养基处理.取诱导后的成肌细胞,加入p44/p42激酶抑制剂PD98059进行干预处理.主要观察指标:western blotting法检测诱导后成肌细胞蛋白标记物MyoD,Myf5的表达,神经元蛋白标记物酪氨酸羟化酶、神经丝的表达,以及p44/p42激酶在成肌细胞蛋白标记物下调过程中的作用.结果:与未诱导的对照组比较,培养的成肌细胞经睫状神经因子预诱导、再加入丹参注射液诱导的过程中,成肌细胞蛋白标记物MyoD,Myf5的表达均明显下调;而诱导后期神经元特异蛋白标记物酪氨酸羟化酶、神经丝的表达增高.丹参诱导后成肌细胞p44/p42激酶发生磷酸化,同时MyoD和Myf5的表达量下调:在p44/p42激酶抑制剂PD98059存在情况下,p44/p42激酶磷酸化及MyoD,Myf5表达量下调均被抑制.结论:经睫状神经因子预诱导后逐渐去分化的成肌细胞,在丹参注射液的诱导下能够成功分化为表达神经元特异蛋白标记物的神经元样细胞,p44/p42激酶通过磷酸化参与了成肌细胞的再分化过程.     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景:体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化.一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例.目的:观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性.方法:取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μJ/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L.睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例.结果与结论:①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构.②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例.其中20 μg/L.的脑源性神经营养因子联合20 μg/t.睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高.提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞.     

睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子对动眼神经切断后猫动眼神经核神经丝蛋白表达的影响

目的:观察外源性睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子对动眼神经切断后猫动眼神经核神经丝蛋白表达的影响。方法:实验于2004-06/2005-06在中南大学湘雅医学院人体解剖学应用解剖研究室完成。选用健康成年猫30只,建立猫动眼神经切断后硅胶管再生室模型,将建模成功20只随机分为4组,分别为脑源性神经营养因子组、睫状神经营养因子组、脑源性神经营养因子+睫状神经营养因子组和生理盐水组,每组5只。术后再生室内分别给予睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、脑源性神经营养因子+睫状神经营养因子和生理盐水各15μL(因子浓度为33mg/L),存活12周后用免疫组织化学方法检测各组动物动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性细胞数及阳性细胞灰度值的变化。结果:猫30只,造模失败10只,最终进入结果分析20只。①各组动物对照侧动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目和灰度值差异无显著性(P>0.05)。②生理盐水组手术侧动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目低于对照侧,差别具有显著性(P<0.05)。各营养因子组术侧动眼神经核的神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目和免疫染色强度均明显高于生理盐水组(P<0.05);③在各营养因子组中,脑源性神经营养因子+睫状神经营养因子组明显高于脑源性神经营养因子组和睫状神经营养因子组(P<0.05),脑源性神经营养因子组与睫状神经营养因子组之间无明显差别。脑源性神经营养因子+睫状神经营养因子组与同组动物未手术侧相比差别均无显著性(P>0.05),而脑源性神经营养因子组和睫状神经营养因子组与同组动物未手术侧相比差别均有显著性(P<0.05)。结论:外源性睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子均可上调动眼神经切断后猫动眼神经核的神经丝蛋白表达,联合应用具有协同作用。     

睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子对动眼神经切断后猫动眼神经核神经丝蛋白表达的影响

目的：观察外源性睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子对动眼神经切断后猫动眼神经核神经丝蛋白表达的影响。 方法：实验于2004-06／2005-06在中南大学湘雅医学院人体解剖学应用解剖研究室完成。选用健康成年猫30只，建立猫动眼神经切断后硅胶管再生室模型，将建模成功20只随机分为4组，分别为脑源性神经营养因子组、睫状神经营养因子组、脑源性神经营养因子＋睫状神经营养因子组和生理盐水组，每组5只。术后再生室内分别给予睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、脑源性神经营养因子＋睫状神经营养因子和生理盐水各15μL（因子浓度为33mg／L），存活12周后用免疫组织化学方法检测各组动物动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性细胞数及阳性细胞灰度值的变化。 结果：猫30只，造模失败10只，最终进入结果分析20只。①各组动物对照侧动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目和灰度值差异无显著性（P〉0．05）。②生理盐水组手术侧动眼神经核内神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目低于对照侧，差别具有显著性（P〈0．05）。各营养因子组术侧动眼神经核的神经丝蛋白免疫反应阳性神经元数目和免疫染色强度均明显高于生理盐水组（P〈0．05）；③在各营养因子组中，脑源性神经营养因子＋睫状神经营养因子组明显高于脑源性神经营养因子组和睫状神经营养因子组（P〈0．05），脑源性神经营养因子组与睫状神经营养因子组之间无明显差别。脑源性神经营养因子＋睫状神经营养因子组与同组动物未手术侧相比差别均无显著性（P〉0．05），而脑源性神经营养因子组和睫状神经营养因子组与同组动物未手术侧相比差别均有显著性（P〈0．05）。 结论：外源性睫状神经营养因子和脑源性神经营养因子均可上调动眼神经切断后猫动眼神经核的神经丝蛋白表达，联合应用具有协同作用。     

大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定

背景:星形胶质细胞被激活后表现出神经干细胞的特性,细胞表面的神经营养因子(表皮生长因子、睫状神经营养因子)受体超表达,通过改善复杂的内环境,有利于定向诱导神经干细胞向神经元的分化。目的:构建大鼠pSecTag2/HygroB-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,检测其在cos-7细胞中的共表达。方法:采用反转录-聚合酶链反应技术从大鼠颌下腺、坐骨神经组织总RNA中扩增出表皮生长因子、睫状神经营养因子基因功能区,将上述基因片段分别连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选、双酶切鉴定后送测序。将构建成功的两种重组载体单独及共转染cos-7细胞,Western blot法鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白的瞬时表达。结果与结论:反转录-聚合酶链反应结果证实成功获得大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子cDNA。DNA序列分析证实2种真核表达载体中的表皮生长因子、睫状神经营养因子序列与GenBank中目的序列一致。脂质体介导转染cos-7细胞48h后,Western blot鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白在cos-7细胞中的表达,分别在Mr6000,22000处出现阳性条带。提示大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子基因的真核表达载体pSecTag2/HygroB-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功,共转染cos-7细胞后能够共表达重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白。     

丹参注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨丹参注射液在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)向神经元样细胞分化的作用.方法:采用贴壁筛选法分离rMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养.采用含丹参注射液的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F-12培养液诱导rMSCs分化为神经元样细胞,观察不同浓度丹参注射液对rMSCs诱导分化为神经元样细胞的影响.通过观察rMSCs经诱导后细胞的形态变化和采用免疫组化方法检测神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定神经元样细胞.结果:经丹参注射液诱导后,rMSCs胞体收缩,突起伸出,形似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NeuN、NF-M表达阳性,GFAP阴性.丹参注射液在浓度为10 ml/L时的诱导作用最为显著.结论:丹参注射液可以在体外诱导rMSCs分化为神经元样细胞,其诱导分化率与丹参注射液的浓度有关.     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景:近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用.目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道.目的:观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力.方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记.诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况.结果与结论:胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶.与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性.提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能.在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞.     

核受体相关因子1基因转染骨髓源性神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元的分化

背景:核受体相关因子1基因修饰是否促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化少见报道。目的:观察核受体相关因子1基因修饰骨髓源性神经干细胞在体外诱导分化为多巴胺能神经元的作用。方法:体外培养和纯化大鼠骨髓源性神经干细胞,将骨髓源性神经干细胞分为4组,将未转染的骨髓源性神经干细胞随机分为对照组,脑源性神经营养因子组;将筛选出的重组质粒转染阳性的神经干细胞分为核受体相关因子1组和核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组。结果与结论:RT-PCR显示转染的骨髓源性神经干细胞4d后核受体相关因子1高表达,分化结果显示:核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组细胞内酪氨酸羟化酶在mRNA水平上的表达量最高,神经干细胞贴壁分化后各组酪氨酸羟化酶阳性细胞比例均明显高于对照组,其中以核受体相关因子1+脑源性神经营养因子组分化比例最高,为(52.44±15.9)%。提示核受体相关因子1基因修饰可促进骨髓源性神经干细胞向多巴胺能神经元分化,并通过脑源性神经营养因子的诱导作用,在体外可获得大量的多巴胺能神经元。     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导

背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限,可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血.目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能.设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意.方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养:取扩增第3或4代的人脐血间危质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸.主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达.结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45.培养基添加神经营养因了诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白.结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞.     

核因子kB在低氧诱导因子1α基因修饰神经干细胞上调血管内皮生长因子表达中的桥接作用

背景:很多研究发现,在脑缺氧损伤区域核因子kB与血管内皮生长因子表达呈正相关.因此,作者大胆假设,核因子kB是否处于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子作用通路上并起桥接作用.目的:以低氧诱导因子1α修饰的神经干细胞为载体,观察核因子kB在低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达通路中的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/12在佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:新生24 h内的Wistar大鼠,雌雄不拘.方法:扩增腺病毒载体低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后转染神经干细胞,荧光检测神经干细胞中低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白及空载体Ad-绿色荧光蛋白表达,分别提取基因转染后神经干细胞、空载体转染神经干细胞、正常神经干细胞蛋白.然后低氧诱导因子1α基因修饰的神经干细胞中按50,150,300 μmol/L浓度梯度加入核因子KB特异性抑制剂二硫氨基甲酸酞吡咯烷,Westem Blot法检测其中血管内皮生长因子的表达变化.主要观察指标:各组神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子kB的表达;给予梯浓度核因子kB特异性抑制剂后神经干细胞中血管内皮生长因子的表达.结果:腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白转染神经干细胞后基因表达强弱与MOI及转染时间有关;转染低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白后的神经干细胞中低氧诱导因子1α、血管内皮生长因子和核因子kB的表达呈正相关;给予梯浓度核因子kB特异性抑制剂后腺病毒低氧诱导因子1α-绿色荧光蛋白修饰的神经干细胞中血管内皮生长因子的表达呈抑制剂浓度依赖性下调,各浓度组之间血管内皮生长因子表达差异有显著性意义(P<0.05～0.01).结论:核因子kB位于低氧诱导因子1α上调血管内皮生长因子表达的信号通路上并起桥接作用.     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景:肌源性干细胞是一种成体多能干细胞,已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点,临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的:探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法,为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计:重复观察测量。单位:武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料:实验于2003-12/2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只,XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司),dispase酶(Gibco公司),鸡胚提取液(自制)。方法:①将大鼠以质量浓度为10g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取腓肠肌,置入冷DMEM培养基中,D-Hank’s液洗涤组织块,除去筋膜、肌腱、神经和血管,剪成1.0～3.0mm3小块,移入离心管。向组织中加入0.2%XI型胶原酶及0.1%的胰酶,采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育1h,未贴壁细胞移入新的培养瓶中,加入新的培养基37℃培养1h后,未贴壁细胞再次转瓶换液,37℃培养过夜,如此反复,每次间隔24h转瓶换液,培养第5～6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70%融合后,胰蛋白酶消化,以1∶2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基,24h后制备细胞爬片,采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标:肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果:①肌源性干细胞的形态观察:从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形,折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形,48h后贴壁完全并开始增生,细胞逐渐延展成梭形或纺锤形,有两极,体积小。随培养时间的延长,细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果:细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性,荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光,阳性率达90%。结论:肌原性干细胞属于成体干细胞,具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点。高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取,免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性,在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质千细胞向神经元样细胞的分化

目的:观察人骨髓间充质干细胞经鼠脑C6胶质瘤细胞上清液诱导后向神经元样细胞方向的分化情况.方法:取肝素抗凝人骨髓血,Percoll梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,胰酶消化后传代扩增.取第4～6代骨髓间充质干细胞,当细胞达90%融合时,按2×103/孔接种于24孔板内,第2天分为两组,诱导组用含有50%C6胶质瘤细胞上清液的完全培养基(含体积分数为0.1胎牛血清的L-DMEM培养基)诱导,每隔2 d换液1次;对照组单纯加入完全培养基进行培养.诱导后3 d,两组细胞采用S-P法进行免疫细胞化学染色,检测神经元特异性标志物的表达.结果:诱导24 h后,诱导组多数骨髓间充质干细胞表现出典型的神经元样外观,对照组细胞形态无明显变化.诱导3 d后,诱导组神经元烯醇化酶阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01);诱导组神经丝蛋白阳性细胞率为(44.2±2.4)%,对照组为阴性:两组胶质纤维酸性蛋白均呈阴性表达.结论:鼠脑C6胶质瘤细胞上清液可成功诱导入骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

脐血源性间充质干细胞向神经样细胞诱导分化的研究

目的探讨来源于人脐带血来源的间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化成神经样细胞的可行性。方法取第5代的脐血间充质干细胞,用不同浓度的脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)单独或联合诱导脐源血间充质干细胞向神经样细胞分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1、3、6天分别进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例。结果与对照组相比,BDNF和CNTF能显著提高人脐血源MSCs分化为神经元的比例。其中20 ng/mL的BDNF联合20 ng/mL CNTF诱导人脐血源MSCs分化为神经样细胞的比例最高。结论人脐血MSCs经BDNF和CNTF体外诱导,能够分化为神经样细胞。     

骨形成蛋白4诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力

目的骨形成蛋白 4( bone morphogenetic protein 4,BMP4)体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力. 方法采用 BMP4体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞,免疫组化鉴定神经丝蛋白( NF)、胶质纤维酸性蛋白( GFAP)的表达. 结果成年大鼠骨髓间充质干细胞受 BMP4诱导后出现神经元样细胞 ,细胞免疫组化显示诱导出的神经元样细胞 NF表达阳性,诱导后 5 h, 12 h, 1 d, 3 d, 5 d和 7 d的 NF神经样细胞阳性率分别为 (40± 7)%, (71± 6)%, (58± 3)%, (53± 6)% , (37± 5)%, (13± 2)% ,诱导后 12 h,NF神经元样细胞阳性表达到高峰 ,与诱导后 5 h比较,差别有显著性 (t=1.380～ 2.621,P< 0.05). 结论 BMP4可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元.     

人胚胎脑组织蛋白提取物诱导人胎盘间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：选择合适的诱导方法诱导人胎盘间充质干细胞分化为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键。目的：在人胎盘间充质干细胞中加入商品化的人胚胎脑组织蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法：采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞,传至第3代,将人早期胚胎脑组织蛋白提取物加入诱导培养基培养6 d,加入浓度为20 nmol/L全反式维甲酸和500μg/L音猬因子培养3 d,换新的培养液,包含体积分数为10%胎牛血清,10μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L神经胶质细胞源性神经营养因子,50μg/L胰岛素样生长因子Ⅱ型继续培养3 d。结果与结论：胎盘组织经酶消化后获得贴壁细胞,传至第2代细胞形态为梭形,成漩涡样生长,传至第3代细胞形态较均一。诱导后细胞经免疫细胞化学法检测均表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43;ELISA法检测细胞培养上清脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4为阳性表达;RT-PCR检测细胞微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43均为阳性表达。结果表明人胚胎脑组织蛋白提取物使人胎盘间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。     

豚鼠脂肪间充质干细胞向类神经元样细胞的分化

背景:目前关于耳科干细胞研究的动物实验大多是将其他动物种属的干细胞用于豚鼠模型,而对于豚鼠本身来源的干细胞研究报道极少.目的:探寻豚鼠脂肪间充质干细胞向神经细胞元样分化的潜能.方法:取豚鼠脂肪,分离脂肪间充质干细胞培养至第3代,cck-8试剂盒检测第1~10天细胞增殖A值,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;成神经诱导并行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200免疫荧光染色.结果与结论:豚鼠脂肪间充质干细胞增殖的生长曲线近似"S"形,传代后经过3 d的潜伏期,3 d后进入对数生长期,8 d后进入平台期,其细胞的免疫表型CD29表达率86.3%,CD44表达率55.5%,CD45表达率为0.4%,成神经细胞诱导后细胞形态与神经细胞类似,巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200染色均呈阳性.说明豚鼠脂肪间充质干细胞在体外易于分离、培养及扩增,具有向神经细胞元样分化的潜能.     

肌源干细胞在组织工程和再生医学的应用

背景：肌卫星细胞是肌组织损伤后修复的主要细胞来源,在肌组织再生研究领域受到广泛关注。目的：综述肌源干细胞生物学特点及在组织工程和再生医学领域的应用,探讨肌源干细胞的临床应用价值和前景。方法：应用计算机检索维普数据库和Pubrned数据库中2000年1月至2011年4月关于肌源干细胞研究应用的文章,在标题和摘要中以“肌源干细胞,肌卫星细胞,组织工程,再生医学,成体干细胞”或“MDSCs, MSCs, ASCs, regenerative medicine; tissue engineering”为检索词进行检索。选择文章内容与肌源干细胞研究应用相关文献,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。初检得到189篇文献,根据纳入标准选择25篇文献进行综述分析。结果与结论：已有的动物实验和成功的临床试验表明,结合基因工程技术和组织工程的基本原则,以肌源干细胞为基础的组织工程化组织和细胞学治疗可以通过安全的措施应用于各种骨骼肌疾病、心肌疾病、泌尿系统和神经系统,为临床医生及相关疾病领域患者提供良好治愈前景。但肌源干细胞研究仍面临着许多问题。     

骨形态发生蛋白9诱导骨骼肌源性干细胞的成骨分化

背景:已有实验报道部分骨形态发生蛋白能够诱导间充质干细胞等向成骨细胞的分化。目的:评估骨形态发生蛋白9定向诱导骨骼肌源性干细胞成骨分化的能力。方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法提取兔骨骼肌源性干细胞,用重组腺病毒的方法将骨形态发生蛋白9导入细胞,通过碱性磷酸酶定量测定、钙盐沉积实验观察骨形态发生蛋白9对于骨骼肌源性干细胞成骨分化的定向诱导作用。结果与结论:成功分离培养兔骨骼肌源性干细胞,免疫细胞化学染色80%以上的细胞呈Sca-1阳性。骨形态发生蛋白9能诱导骨骼肌源性干细胞碱性磷酸酶的表达,且能够促进细胞的钙盐沉积。提示,骨形态发生蛋白9具有定向诱导骨骼肌源性干细胞分化成骨的能力。     

β-淀粉样蛋白诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中Tau蛋白的过度磷酸化

背景：大多数学者认为β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病的始动因素,而Tau蛋白过度磷酸化可能是阿尔茨海默病最重要的分子病理变化之一。目的：观察β-淀粉样蛋白25~35对大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白磷酸化的影响。方法：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,将第4代骨髓间充质干细胞分为两组：实验组中加入预诱导培养基和20μmol/Lβ-淀粉样蛋白25~35,24h后用含2%二甲基亚砜和200μmol/L丁羟茴醚的DMEM诱导其向神经细胞分化,5h后收取细胞。对照组诱导方法同实验组,但在诱导过程中未加入β-淀粉样蛋白25~35。结果与结论：光镜下可见纺锤状的骨髓间充质干细胞诱导后出现长突起,呈现神经细胞样形态,但实验组突起数量和长度均少于对照组;免疫细胞化学法检测两组诱导后的神经元样细胞为神经元特异性烯醇化酶阳性;免疫蛋白印记法证明实验组的GSK-3β、Tau[pSer262]和Tau[pSer396]表达均显著高于对照组。结果提示β-淀粉样蛋白25~35能够通过GSK-3β途径诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白过度磷酸化。     

人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因 Beclin-1 的表达简

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,但是经过长期体外培养后,骨髓间充质干细胞增殖分化能力逐渐丧失,其机制仍不明确。目的：观察人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化过程中自噬相关基因表达的变化。方法：利用表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,观察其形态变化及生长情况。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达,采用Western blot检测诱导前后人骨髓间充质干细胞自噬相关基因Beclin-1表达的变化。结果与结论：经诱导后,人骨髓间充质干细胞呈典型神经元样细胞分化,神经元特异性烯醇化酶阳性率为78.7%,胶质纤维酸性蛋白阳性率为8.1%。诱导0.5 h后处理组细胞中Beclin-1的表达水平有所增加,但1 h后开始逐渐降低。说明体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,自噬相关基因表达活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低。