人类卵巢组织玻璃化冷冻及复苏后形态学及组织增殖活性观察

目的 探讨玻璃化冷冻对成人卵巢组织中原始卵泡与初级卵泡的形态学及细胞增殖状态的影响.方法 采用液氮直接覆盖玻璃化冷冻(direct cover vitrification,DCV)方法冻存成人卵巢组织块,液氮保存2周后复苏组织.观察和比较冻融前后人卵巢组织中原始卵泡与初级卵泡组织形态学改变;免疫组化染色测定经体外培养48 h后新鲜和冻融卵巢组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况.结果 冻融前后人卵巢组织内原始卵泡和初级卵泡分布差异无统计学意义(P>0.05);新鲜卵巢组织中,形态异常的原始卵泡比例与初级卵泡比例差异无统计学意义(P>0.05),冻融卵巢组织中,形态异常的原始卵泡比例低于形态异常的初级卵泡比例(P<0.05);新鲜组、新鲜及冻融后培养组均有PCNA的阳性表达,PCNA 阳性表达可见于中间型卵泡和初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞、卵巢组织间质细胞.结论 利用DCV方法对人卵巢组织进行冻存能够保存原始卵泡和初级卵泡,冻融过程对原始卵泡和初级卵泡形态结构都可能造成一定程度的损伤,冻融后组织内卵泡有体外生长发育的潜力.     

豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡玻璃化冷冻效果比较

目的：比较分析不同玻璃化冷冻配方对豚鼠卵巢组织片和单个窦前卵泡形态、存活率及体外发育能力的影响。方法：取5周龄雌性豚鼠卵巢,实验分新鲜对照组、组织片A液毒性组、组织片B液毒性组、卵泡A液毒性组和卵泡B液毒性组,及相应的冻融组,即组织片A液冻融组、组织片B液冻融组、卵泡A液冻融组、卵泡B液冻融组,共9组行毒性试验和冷冻保存。各组卵巢组织片行HE染色形态学观察,分离窦前卵泡经锥虫蓝染色活力测试并行体外培养。结果：A液冻融组和B液冻融组豚鼠卵巢组织片HE染色光镜观察可见大部分卵泡形态正常,A液组和B液组异常窦前卵泡数与新鲜对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;在分离的窦前卵泡锥虫蓝染色活力测试中,冻融卵巢组织片A组的卵泡复苏率（为66．1％）显著低于（P〈0．05）冻融卵泡B液组（为78．5％）和新鲜对照组（为87．5％）;其余组别之间差异无统计学意义。体外培养卵泡发育情况组织片冷冻组比卵泡冷冻组差,以A液组尤甚,第6天存活卵泡数目不足（为20．0％）,与新鲜对照组（为60．0％）及卵泡B液冻融组（为50．0％）相比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：玻璃化冷冻法能较好地冷冻保存豚鼠卵巢组织片和分离的窦前卵泡,而单个豚鼠窦前卵泡玻璃化冷冻优于卵巢组织片的玻璃化冷冻;B液较A液更适合豚鼠卵巢卵泡的玻璃化冷冻保存。窦前卵泡的体外培养证明玻璃化冷冻复苏卵泡具有一定的继续发育能力。     

胎儿卵巢组织培养与冷冻保存

对人胎儿卵巢的组织培养、冷冻保存后再复苏培养,以观察胎儿卵巢培养前后的形态学变化、培养时雌激素产生的能力以及冷冻保存对胎儿卵巢形态发育及内分泌功能的影响。结果表明:在体外培养条件下,胎儿卵巢的卵泡不仅可以维持培养前的良好形态,而且能够进一步发育成熟;培养时具有雌二醇分泌能力。冷冻保存对胎儿卵巢的卵泡发育和雌二醇分泌功能没有明显影响。提示:将中期引产胎儿卵巢冻存起来,建立“胎儿卵巢库”,可解决临床卵巢移植的供需矛盾。     

玻璃化冷冻对人卵巢组织形态结构及组织增殖活性的影响

目的:探讨玻璃化冷冻对人类卵巢组织卵泡形态、超微结构和组织增殖活性的影响。方法:采用12例人卵巢组织切成薄片随机分配到新鲜卵巢组(A组)和玻璃化冷冻组(B组),两组行组织学光镜和透射电镜检查卵泡形态及结构变化,免疫组化测定卵巢组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果:A、B两组中原始卵泡和初级卵泡分布比例分别为86.4%、13.6%和84.5%%、15.5%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。光镜下A、B两组中形态正常的原始卵泡分别为75.3%和69.3%,两组比较差异亦无统计学意义(P>0.05);但B组冻融后初级卵泡形态异常的比例(56%)高于A组(28.2%),两组比较差异有统计学意义(P<0.05);A、B组中形态正常的原始卵泡超微结构无明显改变,B组中初级卵泡超微结构存在一定程度的改变。A、B两组卵巢中PCNA阳性表达比较差异无统计学意义(P>0.05),PCNA阳性表达主要见于原始和初级卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵巢组织间质细胞。结论:玻璃化冷冻是一种较适宜保存人类卵巢组织的方法。     

慢速冷冻-快速复苏法对人胎儿卵巢组织超微结构的影响

171的探讨慢速冷冻-快速复苏法对人胎儿巢组织超微结构的影响。方法将人胎儿卵巢组织分为新鲜组和冻融组，对冻融前后的胎儿卵巢组织超微结构进行比较。结果与新鲜组相比，冻融组卵巢组织中细胞的超微结构大部分保存良好。冷冻损伤在卵母细胞主要表现为胞浆内的空泡，线粒体水肿，偶见核膜的皱缩；在颗粒细胞主要为轻度盼水肿和少量空泡；间质组织未见明显损伤。结论慢速冷冻-快速复苏法可以较好地保存人胎儿卵巢组织超微结构。     

改良的玻璃化液冻存乳鼠卵巢异体原位移植后生殖功能的恢复

目的 探讨一种改良的玻璃化液冻存乳鼠卵巢,复苏后进行异体原位移植,评价其对卵母细胞成熟、受精及胚胎发育潜能的影响。方法 乳鼠卵巢进行ED20和改良的EG5.5/30液玻璃化冻存,复苏后的乳鼠卵巢一部分酶解消化,通过荧光活力检测卵子的存活率;激光共聚焦显微镜观察α-tubulin的免疫荧光检测卵子内细胞骨架的变化。一部分乳鼠卵巢进行成年去势雌鼠的原位移植。标本随机分为新鲜组和新鲜移植组;ED20液冷冻组和ED20液冻融移植组;EG5.5/30液冷冻组和EG5.5/30冻融移植组。术后15 d,受体鼠同雄鼠合笼,统计移植6个月内的产仔情况;术后6个月,检测恢复动情周期的受体鼠雌二醇(E2)水平。结果 玻璃化冻融乳鼠卵巢后,ED20液冷冻组和EG5.5/30液冷冻组卵子存活率(87.0%,84.6%)低于新鲜组(92.6%)(P<0.05);冻融后卵子内微丝和微管结构受损,荧光强度均低于新鲜组(P<0.05);接受冻融卵巢原位移植的受体鼠可以实现自然产仔,但两冷冻液冻融移植组首窝产仔时间、平均每窝产仔数、产仔总数均较新鲜移植组差异有统计学意义(P<0.05)。结论 改良的EG5.5/30液冻存幼鼠卵巢复苏后异体原位移植同ED20液效果相似,受体鼠可诞生正常子代,但是生殖储备和生育力明显下降。     

人卵子发生过程中卵母细胞PTEN基因的表达及其意义

目的: 研究在人卵子发生过程中PTEN基因与卵母细胞的关系.方法: EnVision免疫组化染色方法检测人卵巢组织中卵母细胞PTEN与PCNA的表达;原位杂交法检测人卵巢组织中卵母细胞PTEN mRNA表达.结果: 8/10例人卵巢的卵母细胞表达PTEN蛋白,10/10例卵母细胞表达PCNA,同时人卵巢次级卵泡内层卵泡膜细胞(theca interna)也表达PTEN,但卵巢的颗粒细胞、卵泡细胞和间质细胞大多不表达或弱表达PTEN与PCNA.PTEN mRNA表达结果基本与 PTEN蛋白一致,7/10例人卵巢的卵母细胞表达PTENmRNA,卵巢的卵泡细胞和间质细胞大多不表达或弱表达PTENmRNA.结论: PTEN的表达可能与卵母细胞的生长、成熟和变大有关.     

兔冷冻卵巢组织自体多点种植后的组织形态和功能

目的：观察兔冷冻卵巢组织子宫系膜、卵巢囊和卵巢内多点种植后组织形态及功能,探讨移植部位和移植方法。方法：15只新西兰白兔随机分为3组,每组5只：1组,新鲜卵巢组织子宫系膜及卵巢囊种植;2组：冷冻卵巢组织子宫系膜及卵巢囊种植;3组：冷冻卵巢组织卵巢内种植。通过卵巢组织光镜和电镜观察、子宫内膜组织光镜观察、阴道脱落细胞学检查,反映种植后卵巢组织存活、卵泡生长发育及内分泌功能等情况。结果： 冷冻复苏组织和新鲜组织相比, 2组、3组移植后组织与冷冻复苏组织相比, 3个移植组间相比,正常卵泡和形态改变卵泡所占比率差异均无统计学意义(P＞0.05）;3个移植组的正常卵泡比率均低于新鲜组织(P＜0.05）;3个移植组卵巢组织中存在正常比例的各级卵泡,并且近成熟卵泡的比率与新鲜卵巢组织相比差异无统计学意义(P＞0.05）,2组、3组移植后组织与冷冻复苏组织比较,近成熟卵泡所占比率增加(P＜0.05）;冷冻后和移植后卵巢组织形态和超微结构无明显改变。结论： 小块卵巢组织冷冻可以获得良好的冷冻保存效果;冷冻卵巢组织自体多点种植后,卵巢组织光镜形态学和超微结构无明显改变,卵泡存活并正常发育;卵巢组织种植于子宫系膜、卵巢囊和卵巢内均可以得到良好的效果。     

胎儿卵巢组织玻璃化冻存效果的研究

目的探讨玻璃化冻存法对胎儿卵巢组织形态和功能的保存效果。方法采用改良EG5.5/30玻璃化液冻存胎儿卵巢皮质片,解冻后观察卵巢组织学变化,卵巢皮质片异种异位移植后,观察受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡发育状况。结果实验组与新鲜培养后移植组、添加抗氧化剂培养后移植组相比动情周期恢复率差异无统计学意义(P>0.05),但高于新鲜移植组(P<0.005);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于两种培养组(P<0.05);在卵泡计数上,实验组每高倍视野的卵泡计数明显高于新鲜移植组(P<0.005),与培养后移植组间的差异无统计学意义(P>0.05)。移植后18周,组织学观察见大量窦卵泡,而培养组仅偶见窦卵泡。结论玻璃化冻存法可有效冻存胎儿卵巢组织,且不影响卵泡继续发育的潜能。     

人卵巢组织两种超低温冻存方法的研究

【目的】探索两种人卵巢组织冷冻方案用于生殖细胞保存的效果。【方法】活检卵巢组织来自15名经知情同意的手术患者。组织被随机分配到新鲜组、玻璃化冷冻组和慢速冷冻组。观察和比较各组卵巢组织冻融后的原始卵泡形态完整率,并通过体外培养系统测定培养液中的雌二醇和孕酮水平,观察和比较冻融后卵巢组织内分泌功能。【结果】本研究中新鲜组、慢速冻融组和玻璃化冻融组的原始卵泡形态完整率分别是97.6%、72.6%和80.3%。两冻融组与新鲜组相比明显下降(P<0.001),而在两冻融组间差异并无统计学意义(P=0.237)。在体外组织培养期间,两种冻融卵巢组织都能持续分泌雌二醇和孕酮,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】本研究中两种人类卵巢组织超低温冷存的方法是可行的,可适应不同需要。     

人类卵子体外成熟及其胚胎冷冻复苏研究

目的:探讨取卵周期准备、卵泡发育状态、培养液成分对未成熟卵的获取率、体外成熟率、受精率、胚胎质量、胚胎移植后成功率及其胚胎冷冻复苏移植的影响。方法:19例进行卵子体外成熟的不孕不育患者为研究对象。其中1例为自然周期,14例为促性腺激素(Gn)诱导排卵周期,4例常规控制性促排卵(COS)周期;分别以TCM 199或人输卵管液(HTF)为基础培养液,进行卵子体外成熟培养。结果:当取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,获卵率、受精率和胚胎质量下降;TCM 199组优质胚胎的形成率显著高于HTF组(P<0.01)。IVM胚胎经冷冻复苏、胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。结论:在IVM周期取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,将影响胚胎着床率和累积妊娠率。TCM 199优于HTF培养液,能提高未成熟卵体外成熟后受精卵所形成胚胎的发育能力。IVM胚胎经冷冻复苏-胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。     

冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取

目的 探求冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取。方法 取手术切除的5例患者的卵巢皮质，放入1．5mol／L的二甲基亚砜＋10％血清中，应用可控程序冻冰仪逐渐降温，移入液氮中冻存。3个月后，将融解的卵巢皮质移植入90只裸鼠皮下，注射hFSH12周，刺激卵泡生长。注射hCG36h后，用18号针头穿刺提取卵细胞。结果 卵巢直径为3～9mm，穿刺获19个卵细胞，放入TC-199培养基，加20％胎牛血清。25mmol／L丙酮酸，75mIU／mLFSH和LH培养，获15个分裂中期的次级卵母细胞。结论 人卵巢组织冻融后可异体移植生长，且其卵细胞可在体外发育成熟。     

玻璃化冷冻对小鼠窦前卵泡体外培养及卵子骨架的影响

目的分析玻璃化冷冻对小鼠窦前卵泡体外生长、发育及成熟后卵子细胞骨架的影响。方法超薄型开口拉细麦管(super open pulled straw,SOPS)玻璃化冷冻12~14日龄小鼠窦前卵泡,解冻复苏后,将卵泡移入α基础培养液(αmini mumessential medium,α-MEM) 10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS) 0.075I U/mL卵泡刺激素 胰岛素-转铁蛋白-硒 10mI U/mL人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)中培养,隔日换一半培养液。第12d将卵泡转入α-MEM 10?S 1I U/mL HCG 5ng/mL表皮细胞生长因子,16~18h后收集卵子。免疫荧光技术测定卵子纺锤体和染色体结构。结果卵泡解冻后成活率为92.0%,卵泡体外生长速率、卵泡腔形成与新鲜卵泡相比均没有明显改变(P>0.05)。冷冻对卵泡成熟后卵子骨架和染色体没有显著影响(P>0.05)。结论SOPS玻璃化冷冻技术是一种高效可靠的卵泡冷冻方法。     

In vitro maturation of immature oocytes and IVF/ICSI in PCOS patients

In vitro maturation (IVM) programme has developed a culture technique for supporting the growth and maturation of immature oocytes since late of 1980s and has become important in ART methods. The establishment of an IVM programme can yield many advantages. Patients suffering from congenital or postnatal reproductive disorders, such as premature ovarian failure (POF) or polycystic ovarian syndrome (PCOS), can achieve pregnancies by transfer of viable embryos derived from IVM and in vitro fertilisation (IVF) systems. However, the pregnancy rate of IVM-IVF programme for PCO patients was still low. This disadvantage was caused by poor maturation of human immature oocytes and no synchronisation with implantation windows. Recently, application of FSH/hCG priming or optimal maturation medium for proper cytoplasmic maturation improves the success rate of IVM procedures. Indeed, increasing oocyte viability by employing optimised IVM system would also reduce ethical concerns about the disposal of retrieved oocytes with low developmental competence, and concerns about the abuse of the manipulation of human embryos.     

冷冻保存对人始基卵泡中颗粒细胞的影响

目的：探讨冷冻保存对人始基卵泡中颗粒细胞的形态及存活率的影响。方珐：程序冷冻法保存人卵巢组织．采用常规组织学检测冷冻前后卵泡中颗粒细胞形态,并采用胶原酶消化联合镜下机械分离卵巢组织中的始基卵泡．采用双荧光标记,检测冷冻前后人卵巢组织分离始基卵泡中颗粒细胞的存活比例。结果：形态学检测发现,冷冻前卵巢组织中颗粒细胞发生损伤的始基卵泡占12．4％．卵母细胞损伤20．6％：冷冻后两者的比例分别为23．3％与24．4％。荧光标记的冷冻前卵巢组织中颗粒细胞存活的始基卵泡占72．7％,〈50％颗粒细胞存活的卵泡仅占3．6％,卵母细胞存活率为85．5％;冷冻组中颗粒细胞存活的始基卵泡占79．5％,〈50％颗粒细胞存活的卵泡仅占2．5％,卵母细胞存活率达86．1％。结论：冷冻复温的过程主要破坏卵泡中的颗粒细胞．而对卵母细胞的损伤很小。     

In-vitro Maturation of Immature Oocytes from Preantral Follicles in Prepuberal Mice

Objective To observe the morphological changes in in vitro growth of preantral follicle isolated from prepuberal mice and to assess impacts of gonadotropin （Gn）, insulin transferrin selenium （ITS） and epidermal growth factor （EGF） on their development. Methods Early preantral mice follicles （90-130μm diameter） were mechanical isolated and selected from 2 weeks＇ old mice and then cultured in alpha-minimal essential medium （α-MEM） with or without Gn, ITS and EGF. The preantral follicles were cultured singly in 20 miovliters droplets for up to 14 d. The medium was replaced and the .follicles were observed everyday. Granulosa cells （GC） prolification, antrum formation and oocyte maturation were recorded. Results The medium with Gn supported preantral follicle culture in vitro, during which they retained a three-dimensional structure, maintained oocytes viability and increased in diameter and number of somatic cells＇. Preantral follicles cultured in Gn medium grew obviously, while those without Gn grew slowly and after 6 d＇s culture began to shrink and blacken. Significant increase in survival rate and maturation rate of oocytes was observed in Gn group （P〈0.01）, with 92.9% survived and 28.7%formed an antrum. Further supplementation of the Gn medium with ITS and rLH, resulted in the significant increase in survival and maturation of preantral follicle （P〈0.05） Conclusions α-MEM can be the medium for in vitro culture （IVC） of preantral follicles, but need to be added with rLH/rFSH, rHCG/rEGF to facilitate thecal cell attachment, GC proliferation and oocyte maturation.     

超速冷冻法冷冻保存大鼠卵巢组织的实验研究

目的探讨超速冷冻法对SD大鼠卵巢组织的冷冻保存功效。方法采用液氮直投法冷冻大鼠卵巢组织。计数冻融后卵巢组织内形态正常始基卵泡数量。将卵巢组织自体移植，术后35天处死动物，测定血清雌二醇（E2）水平。结果新鲜和冻融后的大鼠卵巢组织中形态正常始基卵泡数量无统计学差异（P〉0.05）。移植术后35天，两移植组血清E2水平无统计学差异（P〉0.05）。结论液氮直投超速冷冻法可以有效的保存卵巢组织，对大鼠卵巢组织学和功能的影响较小。     

大鼠卵巢颗粒细胞IGF-Ⅰ、TGFβ、Fas-L表达与卵泡闭锁发生的研究

为研究ＩＧＦ－Ⅰ,ＴＧＦβ和Ｆａｓ－Ｌ在维持卵泡颗粒细胞存活和介导颗粒细胞凋亡中的作用,探讨卵泡闭锁的局部分子机理,将ＳＤ大鼠卵巢石蜡切片,用ＴＵＮＥＬ法和ＰＣＮＡ免疫组化法区别闭锁和生长卵泡,用免疫组化法标记这三种因子以及它们的膜受体在卵泡内的表达。结果显示：无腔和有腔生长卵泡内大多数颗粒细胞为ＰＣＮＡ阳性;早期有腔闭锁卵泡有５个以上颗粒细胞被ＴＵＮＥＬ法标记,部分颗粒细胞为ＰＣＮＡ阳性;晚期有腔闭锁卵泡剩余颗粒细胞多数被ＴＵＮＥＬ法所标记,但为ＰＣＮＡ阴性。有腔生长卵泡颗粒细胞ＩＧＦ－Ⅰ、ＩＧＦ－ＩＲ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲ、Ｆａｓ、Ｆａｓ－Ｌ均为阳性。早晚期有腔闭锁卵泡的颗粒细胞为Ｆａｓ、ＴＧＦβ和ＴＧＦβＲ阳性。结果提示：ＴＵＮＥＬ法和ＰＣＮＡ免疫组化联合运用有利于区分闭锁卵泡和生长卵泡。ＩＧＦ－Ⅰ仅对有腔生长卵泡颗粒细胞有促进增殖和维持存活的作用,其表达的下降和消失为有腔卵泡闭锁的重要诱因。ＴＧＦβ、Ｆａｓ－Ｌ和Ｆａｓ可能介导有腔卵泡颗粒细胞的凋亡,参与闭锁过程,但在有ＩＧＦ－Ⅰ存在的条件下,其介导作用可能受到抑制