逆转录病毒介导Fcy::Fur/5-FC基因治疗对脑胶质瘤杀伤作用的研究

目的研究融合型自杀基因FcyFur联合5-FC对胶质瘤细胞株C6的杀伤效果.方法扩增FcyFur基因并构建FcvFur基因重组逆转录病毒载体PLXSN-FcvFur;载体转染包装细胞PT67获得高滴度病毒再转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;以MTT法和FCM法检测5-FC对FcyFur转基因细胞的杀伤效应.结果PCR法扩增出全长FcyFur基因,经测序证实序列正确;PLXSN-FcyFur滴度为3×106CFU/ml;RT-PCR检测显示FcyFur转基因阳性克隆的C6细胞有效表达目的基因的mRNA;应用5-FC后FCM法检测到显著的凋亡峰,MTT法检测细胞有明显的杀伤效应.结论融合型自杀基因FcyFur联合5-FC可对胶质瘤细胞C6产生明显的杀伤作用.     

逆转录病毒介导Fcy::Fur融合基因联合5-FC治疗裸鼠体内胶质瘤实验研究

目的:构建含融合自杀基因Fcy::Fur重组逆转录病毒,用自杀基因治疗系统Fcy::Fur/5-氟胞嘧啶(5-FC)对裸鼠胶质瘤进行体内抑瘤作用的实验研究.方法:扩增Fcy::Fur基因并构建Fcy::Fur基因重组逆转录病毒载体:载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;构建稞鼠荷胶质瘤动物模型,腹腔注射5-FC,观察裸鼠肿瘤重量变化及电镜、流式细胞仪(FCM)检测肿瘤的凋亡.结果:PCR法扩增出全长Fcy::Pur基因,经测序证实序列正确;构建了PLXSN-Fcy::Fur逆转录病毒载体,裁体转染包装细胞PT67,获得滴度为3.5×106 CFU/ml的逆转录病毒:转染C6获转基因阳性克隆C6-Fcy::Fur,检测C6-Fcy::Fur有Fcy::Fur基因的mRNA表达;裸鼠前肢背部接种转基因细胞,成瘤后腹腔注射5-FC,转基因肿瘤的生长较对照组明显抑制.FCM法检测到凋亡峰,电镜观察到转基因肿瘤细胞有凋亡小体.结论:AdE1CMVCD与5-FC联合在体内对胶质瘤有明显的抑制作用,为临床胶质瘤基因治疗提供了可靠的理论及应用依据.     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的研究融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-氟胞嘧啶（5-FC）对人卵巢癌细胞株（SKOV3）的杀伤作用。方法构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达。以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应。结果测序鉴定证实插入片段正确。细胞转染24h后,60%转染细胞发出绿色荧光。经G418筛选,RT-PCR和Westernblot法检测到Fcy∶∶Fur表达。加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰。结论融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-FC对人卵巢癌细胞SKOV3有明显的杀伤作用。     

融合型自杀基因系统Fcy：：Fur／5-FC对人肝癌细胞株HepG2体外杀伤作用的初步研究

目的研究融合型自杀基因Fcy：：Fur联合5-氟胞嘧啶（5-Fc）对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。方法应用脂质体介导法将Fcy：：Fur基因转染人人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选2周后行有限稀释法获得稳定表达Fcy：：Fur基因的单克隆细胞。5-Fc处理后,通过MTF法和AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法,检测Fcy：：Fur／5～FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的细胞增殖及凋亡的影响。结果MqT法检测显示稳定表达Fcy：：Fur基因的HepG2单克隆细胞经5-Fc处理后,在1、2、3、4、5天时对细胞的增殖有明显抑制作用。AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法检测细胞凋亡率：1天为5．74％,2天为11．04％,3天为17．56％;PBS处理的细胞凋亡率：1天为3．67％,2天为3．68％,3天为4．42％,凋亡率无明显改变。结论Fcy：：Fur／5-FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的增殖有明显的抑制作用,并可促进肿瘤细胞凋亡。     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体，拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板，采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因，并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出，按正确阅读框架克隆进pLXSN中，重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明，扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达；重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体，为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的 研究融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对人卵巢癌细胞株(SKOV3)的杀伤作用.方法 构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达.以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应.结果 测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,60%转染细胞发出绿色荧光.经G418筛选,RT-PCR和Western blot法检测到Fey::Fur 表达.加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰.结论 融合型自杀基因Fey::Fur联合5-FC驿人卵巢癌细胞SKOV3有明显的刹伤作用.     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞,G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞）,使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞,MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感,IC50 约为6 500 μmol/L,而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后,U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用;为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

槲皮素对大鼠脑胶质瘤C6细胞增殖调控的作用

目的：研究类黄酮化合物槲皮素（quercetin,QUE）对体外培养的大鼠脑胶质瘤C6细胞增殖调控的作用。方法：按QUE浓度分成10、25、50、75及100 μmol·L^-15个处理组和空白对照组（生理盐水）及溶剂对照组（二甲亚砜）,大鼠脑胶质瘤C6细胞在RPMI 1640培养基中生长达1×10⁶·mL^-1后,在96孔板中分别加入上述浓度的QUE继续培养,每组设3复孔,作用24、48及72 h,采用MTT比色法检测QUE对大鼠脑胶质瘤C6细胞的增殖抑制情况,流式细胞术（FCM）对50及100 μmol·L^-1的QUE作用48 h的大鼠脑胶质瘤C6细胞进行周期分析,免疫组化法检测50 μmol·L^-1的QUE作用48 h 的p53和bcl-2基因产物。结果：与空白对照组比较,QUE处理组随药物浓度增加和作用时间的延长,A值减小(P<0.05),对C6细胞的增殖抑制作用增强,使停滞在G₀／G₁期的细胞增加(P<0.01),而S和G₂/M期细胞减少(P<0.05)。P53蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达减少。结论：QUE对C6细胞增殖抑制作用具有浓度、时间依赖性,通过P53蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达减少诱导细胞凋亡来实现。     

恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统的建立

目的 建立针对恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法 以大肠杆菌大量扩增制备含有胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD质粒并经酶切电泳鉴定。DNA序列测定证实pCMVCD质粒是否含有所需要之CD目的基因。用Lipofectamine2000脂质体介导法将pCMVCD质粒转染进入SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞．经G418筛选获得抗性克隆（定名为SHG-44／CD细胞）。结果 pCMVCD质粒经测序证实含有CD目的基因。脂质体介导pCMVCD质粒成功转染了SHG-44细胞。结论 建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶｔｋ）基因导人恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷（ＧＣＶ）可选择性地杀死肿瘤细胞．本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并切除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞，４８ｈ后，在光镜下观察细胞形态及进行活细胞计数．结果表明，ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用.方法 将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer 5.1-H1 Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT6细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响.结果 重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达224×10 4cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3 d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.     

Apigenin/GCV对C_6-TK细胞株的杀伤效应及作用机制

目的探讨Apigenin/GCV对体外培养鼠胶质瘤C6细胞的杀伤效应及作用机制。方法对含有导入pcDNA3-TK质粒的C6细胞进行培养、传代：通过MTT法、TUNEL实验法及光镜技术检测GCV/Apigenin对检测不同组别C6细胞C6-TK细胞株的杀伤效应。结果给GCV＋Apigenin后：转染组、空载体组和对照组中两两比较：转染组的细胞增殖水平显著低于空载体组和对照组（P〈0.05）;相对未处理组,用10μmol/LApigenin预先处理6h后,GCV对C6混合细胞的杀伤效应显著增强（P〈0.01）。结论缝隙连接功能上调剂Apigenin可显著提高HSV-TK/GCV肿瘤自杀基因系统的＂旁观者效应＂及显著促凋亡作用。GCV的作用效能对细胞间通讯功能有一定的依赖性。     

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。     

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV-TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK;采用DOTAP将其转入PA317细胞中进行包装,筛选,并进行病毒滴度测定。收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS732和SAOS-2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒,HSV-TK基因已整合到宿主细胞基因组中,并获得表达,MTT比色法测定结果显示GCV对OS732TK和SAOS-2TK细胞均有明显的杀伤作用。且前者强于后者,旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度,在SAOS-2细胞中的作用强于OS732。结论 HSV-TK/GCV基因治疗系统可为骨肉瘤的治疗提供新途径。     

雌激素对C6神经胶质瘤细胞的作用

目的　从细胞与分子水平观察雌激素受体 (ER)α,β2种亚型在C6神经胶质瘤细胞的表达 ,初步研究雌激素对大鼠C6星形神经胶质瘤细胞的细胞活性、增殖活动和细胞[Ca2 + ]i 水平的影响 .方法　应用细胞培养、免疫细胞化学、RT PCR技术、MTT法、3 H TdR掺入法和激光扫描共聚焦技术 .结果　①C6细胞中检测到ERβ免疫反应阳性物质 ,未发现ERα免疫反应阳性物质 ;②ERβmRNA在C6细胞中有表达 ,未检测到ERαmRNA ;③ 17β estradiol (10 -7～ 10 -5mol·L-1)可显著提高C6细胞活力 ,但对细胞增殖程度无明显的影响 ;④ 17β estradiol (10 -6mol·L-1)作用后数 10s后C6细胞 [Ca2 + ]i荧光强度显著增强 .结论　C6细胞表达ERβ的mRNA与蛋白 ,在神经胶质瘤细胞中ERβ可能是介导雌激素信号传递的关键环节 ;雌激素可发挥细胞保护作用 ;雌激素使细胞 [Ca2 + ]i增加 .     

131I近距离放射对C6胶质瘤细胞杀伤的实验研究

目的 探讨131I近距离放射杀伤培养C6胶质瘤细胞的有效剂量率及有效剂量,指导治疗计划.方法 将负载活度60mCi 131I的放疗囊置于距离培养的C6胶质瘤细胞5mm、30mm处照射,持续72h/次,每隔4d用Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术以及克隆形成率法检测照射后C6胶质瘤细胞的凋亡率和细胞存活分数.结果 照射72h后能诱导部分瘤细胞凋亡,凋亡率可达16.42％±1.66％;瘤细胞存在增殖性死亡现象;瘤细胞存活分数在72h照射后下降,最低为59.0％±2.39％;在131I近距离放射时,较低剂量率(＜400mGy/h)情况下,也可诱发C6胶质瘤细胞凋亡.在剂量率186.6-677.8mGy/h区间,随剂量率加大凋亡率反而减小.诱导瘤细胞凋亡的有效吸收剂量率应≥47.64-61.65mGy/h,72h累计吸收剂量≥3.9Gy.结论 放疗囊负载131I近距离照射72h后可诱发C6胶质瘤细胞部分凋亡,瘤细胞存活分数下降.诱导C6胶质瘤细胞凋亡的有效剂量率应≥47.64-61.65mGy/h,72h有效累计吸收剂量≥3.9Gy.     

脂质体介导B7基因在C6胶质瘤细胞中表达的实验研究

目的 通过脂质体介导基因转移方法,将含B7基因的重组逆转录病毒表达质粒导入C6细胞中。使之能有效的表达B7分子,探索胶质瘤免疫基因治疗的新方法。方法 用脂质体将pLXSN—B7重组表达质粒导入Wistar大鼠胶质瘤细胞系C6中,经G418筛选出阳性克隆。通过PCR、狭缝杂交及B7单克隆抗体免疫荧光方法检测B7基因在C6细胞中的整合、转录及表达情况。结果 PCR可从B7基因转导的C6细胞(C6pLXSN-B7)基因组中扩增出0．8 kb的B7基因片断;以B7为探针狭缝杂交显示C6pLXSN—B7细胞中有B7基因的转录;以抗-B7单克隆抗体进行的免疫荧光检测显示C6pLXSN—B7细胞表面有B7分子的表达,而对照组肿瘤细胞(C6pLXSN、C6)则无B7分子的表达。结论 脂质体介导B7基因转移方法可将B7基因完整整合到C6细胞基因组中并使之能稳定、有效的表达。     

Ttll1对C6胶质瘤细胞作用的研究

目的:探讨微管酪氨酸连接酶1(tubulin tyrosine ligase-like 1,Ttll1)对C6胶质瘤细胞生长的影响。方法:构建pEGFPN1-Ttll1真核表达载体,将pEGFPN1-Ttll1表达载体和pEGFPN1荧光空载体分别转染C6细胞系,荧光显微镜观察拍照,采用Scion Image软件测量每个视野中转染细胞总数和每个转染细胞的突起总长度及细胞体的面积;流式细胞术分析细胞周期;MTT试验检测细胞活力。结果:转染pEGFPN1-Ttll1的C6细胞的胞体面积比转染pEGFPN1的C6细胞的胞体面积小,且前者的突起长度比后者短,两者都有极显著性差异;转染pEGFPN1-Ttll1后未影响C6细胞的细胞周期,也未发现细胞凋亡;转染pEGFPN1-Ttll1后与转染pEGFPN1相比,细胞活力差异无统计学意义。结论:Ttll1可能对C6胶质瘤细胞胞体和突起的生长起负性调控作用,但并没有影响细胞周期和细胞的活力。     

清脑和血方治疗大鼠脑胶质瘤的药效作用及其初步机制研究

目的观察清脑和血方对大鼠脑胶质瘤的药效作用,并初步探讨其作用机制。方法 Wistar大鼠45只,采用脑立体定位注射鼠源性C6胶质瘤细胞(C6细胞)建立大鼠胶质瘤模型;将成模大鼠随机分为模型组、顺铂组、清脑和血方组,每组10只;另设10只大鼠为空白对照组。连续给药25天,检测各组大鼠血清白细胞介素(IL)-2、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ水平;依次剥离脑组织与胶质瘤组织,称重,计算瘤重占脑组织重百分比;HE染色观察胶质瘤组织病理;免疫印迹法检测胶质瘤组织中环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的表达情况。结果与模型组比较,清脑和血方组大鼠的瘤重[(0.0121±0.0050)g比(0.0779±0.0390)g]、瘤重占脑组织重百分比[(0.49±0.0075)%比(3.07±0.0176)%]、血清中IL-2[(91.14±10.33)pg/mL比(160.42±15.98)pg/mL]、IL-10[(49.58±6.79)pg/mL比(92.17±7.71)pg/mL]含量均明显降低(P0.01);血清IFN-γ[(198.54±11.83)pg/mL比(111.53±17.50)pg/mL]、TNF-α[(209.41±21.82)pg/mL比(119.00±20.21)pg/mL]含量明显升高(P0.01)。结论清脑和血方能够明显抑制大鼠C6胶质瘤细胞的颅内生长,其作用机制可能与调节机体免疫因子水平,抑制肿瘤相关蛋白CREB的表达有关。     

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

【目的】 探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】 用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】 经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×10~4 cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC-7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC-7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC-7901/tk有明显杀伤作用,对SGC-7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1-tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】 将HSV1-tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1-tk(基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。