脐血造血干／祖细胞的密度分离实验研究

目的：为建立脐血造血细胞库,减少脐血储存空间,探讨脐血造血干／祖细胞的密度分离效果。方法：选用五种不同比密的Ficoll分离液（1.084、1.077、1.072、1.064、1.054g/L）分离脐血细胞,采用流式细胞技术（FCM）和全自动血细胞分析仪分析了41例脐血造血干／祖细胞和有核细胞（NC）的回收率并作了对比研究。结果：1.064g/L Ficoll分离脐血有核细胞回收率3.6％,淋巴细胞去除率为86.6％;所分离的单个核细胞(MNC）中CD34^ 细胞平均纯度为10.3％,最高可高达46.6％;所分离的细胞体外易形成CFU－GM及BFU－E。结论：不同比密分离脐血造血干／祖细胞具有不同影响。其中1.064g/L Ficoll分离脐血造血干／祖细胞是一种方便、实用、有效的方法。所分离的细胞体外有较强的增殖能力。     

脐血干细胞的分离方法比较

目的:为合理选择脐血干细胞的分离方法提供参考.方法:采用改良HES(羟乙基淀粉)沉降分离法和Ficoll分离法分离脐血干细胞,比较两种方法分离前后的有核细胞数、分离后的CD34 细胞数、分离后的有核细胞回收率及台盼蓝拒染率.结果:改良HES沉降分离法和Ficoll分离法分离前的脐血量、有核细胞浓度和细胞数差异无统计学意义(P＞0.05);分离后改良HES法有核细胞数、CD34 细胞数、有核细胞回收率高于Ficoll 分离法(P＜0.05),而显示有核细胞活力的台盼蓝拒染率两种方法比较差异无统计学意义 (P＞0.05).结论:改良HES分离法的有核细胞回收率高,分离速度快、污染机会小、终体积小,是脐血干细胞分离较好的方法.     

造血干细胞库脐血的采集和分离

脐血移植对于各种儿童疾病和最近增多的成年病人而言已证实是一种合适的治疗方法。需要将脐血做HLA检测后再置脐血库冷冻保存。为了尽可能地利用贮存空间,需要将脐血分离后保存。几种早期的脐血分离方法可造成干细胞的大量损失。作者应用了一个分离程序,用离心机将脐血分为白膜层、红细胞和血浆3部分。对25份(平均初始体积为81ml)进行了评估。从白膜层回收有核细胞。在白膜层中有核细胞数、总的干细胞和CD34阳性细胞的回收率分别为90％、88％和100％。用有氧和厌氧培养检查白膜层的无菌状况。用     

脐血造血细胞的分离冻存

目的 探讨不同条件对脐血造血细胞回收的影响。方法 运用6％羟乙基淀粉(HES)沉降法分离脐血，以程序降温法冻存脐 血造血细胞。结果 HES两次离心法分离脐血，造血细胞回收率高，活力好，费时短。脐血分离前在4℃或室温下可放置24小时而不影响细胞活力。HES终浓度以1％～2％为宜。以0．9％生理盐水 DMSO做保护剂对脐血造血细胞损伤小。复苏后脐血造血细胞可放置60分钟，洗涤会造成约10％的细胞损失，但能延长放置时间达120分钟以上。结论 HES两次离心法分离脐血简便实用。     

羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化

目的　进一步提高HES(羟乙基淀粉 )沉降法分离脐血单个核细胞的收率。方法　对比和分析对该沉降过程完成后上下层的白细胞数 ,并考察HES浓度、HES与脐血体积比、沉降距离对该过程白细胞收率的影响。结果　沉降过程存在因红细胞团向下沉降而推动白细胞向上运动的对流现象 ,该现象受到细胞占悬浮液总体积的比例和红细胞下降速度的影响 ,增加沉降距离能增加对流的作用距离 ,有利于提高白细胞的收率 ,提高HES与脐血的体积比也有利于提高白细胞收率。悬浮液中HES浓度 <0 .6 %时 ,细胞不能有效沉降 ,>3%时 ,会引起白细胞在红细胞中的夹带而影响收率。用 3%HES以 2∶1与脐血混合 ,在沉降距离为 2 5cm的沉降管中沉降 4 0min ,分离后白细胞收率达 94 .3%。结论　采用 3%HES溶液 ,并提高HES与脐血的体积比和增加沉降距离 ,可进一步提高HES沉降法分离脐血单个核细胞的收率     

不同分离方法分离脐血造血细胞效率的比较

目的　探索一种高效快捷可适用于大型脐血库分离脐血造血细胞的理想方法。方法　以改良的羟乙基淀粉 (HES)分离法为主体 ,Ficoll密度梯度离心法、明胶法和自然离心沉降法进行对比 ,系统比较 4种分离方法分离脐血总有核细胞 (TNC)、单个核细胞 (MNC)和CD34+ 造血细胞分离的得率效果。结果　 4种分离方法在分离脐血TNC、MNC及CD34+ 造血细胞得率方面存在着显著性差异 ,其中以HES法和明胶法效果较好 ,两方法间无显著性差异 ,分别能使TNC、MNC及CD34+ 造血细胞的得率平均可达 90 .0 %、89.0 %、90 .0 %和 82 .7%、83.3%、84 .5 %。相比之下 ,HES无论在操作时间、操作过程、造血细胞的终体积和细菌污染率等方面都更具有明显优势。结论　HES法是一种高效、实用的脐血造血细胞分离方法 ,可适用于大型脐血库     

外周血单个核细胞分离方法探讨

目的 探讨外周血单个核细胞(PBMC)的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法 取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉(hydrixyethylstarch，HES)自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)培养。结果 HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficou密度梯度离心法分离的PBMC回收率分别为86．4％、86．0％、85．1％。结论 羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。     

CD34+造血祖细胞的定向诱导分化研究

目的：探讨不同细胞因子组合定向诱导ＣＤ３４＋细胞向红系、粒系、巨核系及树突状细胞（ＤＣ）分化的能力。方法：利用免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）分离纯化脐血ＣＤ３４＋细胞，在液体培养体系中经不同细胞因子组合的诱导，检测各系祖细胞及ＤＣ的扩增倍数。结果：干细胞因子、白细胞介素（ＩＬ）３、ＩＬ６、粒巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、血小板生成素的不同组合，可使红系、粒系或巨核系细胞优势生长，其祖细胞可分别被扩增１４．９７±２．８９，１４．４６±３．１９及３４．６７±４．６２倍，ＣＤ４１ａ＋细胞增加了１７．２９±２．３４倍，ＦＬＴ３配基＋ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ４＋肿瘤坏死因子α的组合可诱导ＣＤ３４＋细胞形成大量树突状细胞，ＣＤ１ａ＋细胞的比例增至２４．２８％±２．１４％（对照组为０．３６％±０．２８％）。结论：不同细胞因子组合可定向诱导ＣＤ３４＋细胞向红系、粒系、巨核系及树突状细胞分化，这在造血调控研究、造血细胞支持治疗及肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景     

脐血造血干细胞库建立及其临床应用

目的 建立脐血造血干细胞库,用于治疗白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血等疾病。方法 采集新生儿脐血,用6％HES离心法分离脐血有核细胞以缩小脐血体积,样本以10％DMSO保存,检测有核细胞数、CD_(34)~+、CFU-GM及HLA,并作病原学捡测。结果 收集590份脐血,合格230份(合格率39％),平均脐血体积(89±20)ml,平均有核细胞数(1.48+0.36)×10~9,分离后有核细胞数(1.25±0.28)×10~9,有核细胞回收率(91+7)％,脐血CD_(34)~+细胞的百分率为(0.37±0.26)％,复苏后CFU-GM回收率为84％,平均每份脐血含CFU-GM(0.9±0.4)×10~6个集落,14％的样本CMV抗体阳性。73人查询,HLA 4个抗原以上相合率为95.7％。至2001年7月,提供3份脐血用于非亲缘脐血移植,1份用于亲缘脐血移植,3例植入,1例排斥。结论 建立脐血库有良好的应用前景。     

脐血造血干/祖细胞冷藏效果的比较研究

目的：探讨脐血细胞和1.064g/L ficoll分离的脐血造血干／祖细胞（简称1064脐血造血干／祖细胞）在不同冷藏条件下的效果。方法：21例脐血和12例1064例脐血造血干／祖细胞在4℃保存；16例1064脐血造血干／祖细胞分别冷藏在－80℃和－196℃，观察不同时间造血细胞活性；单个核细胞（MNC）采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术（FCM）测定，体外造血细胞培养技术分析粒－单系祖细胞（CFU－GM）和红系祖细胞（CFU－E)产率，台盼蓝着色法判断造血细胞活率。结果：脐血细胞在4℃保存第1、2d时，MNC、细胞活率、CFU－GM和CFU－E产率均无明显改变，第3d-5d CFU-GM和CFU－E产率明显下降；1064脐血造血干／祖细胞在4℃保存第3d出现CFU－GM和CFU－E的下降，至第5d下降更显著；1064脐血造血干／祖细胞冷藏在－80℃和－196℃，在半年内CFU－GM、CFU－E、CD34^ 细胞及细胞周期无显著变化，在－80℃冷藏一年时，CFU－GM、CFU－E和CD34^ 阳性细胞下降显著，而－196℃储藏一年时，上述指标及细胞周期无明显改变，98％以上的细胞处在G0－G1期。结论：脐血细胞4℃保存时间不宜超过3d；1064脐血造血干／祖细胞于－80℃和－196℃冷藏在半年内效果一致；－196℃长期冷藏脐血造血干／祖细胞是一种最可靠的方法，但－80℃冷藏脐血造血细胞是一种值得会尝试和实用、费用低的有效方法。