以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n（pGL-MDR1）∶n（pRL-TK）=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较

目的 研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别.方法 PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC).以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Western blot检测目的 蛋白在不同时间段的表达.PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR).pGL-MDR分别与pcDNA3.1/His-GXB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性.实验数据以SPSS 11.5软件分析.结果 成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体.Western blot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高.当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2～1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC-XC pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系.结论 B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型.     

稳定沉默TRB3细胞模型及TRB3启动子报告基因的建立

构建人TRB3基因的shRNA真核表达载体和稳定沉默TRB3的人结肠癌细胞系HCT-8,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因,为以TRB3为靶点的药物研究提供有效的筛选平台。针对TRB3的mRNA设计寡核苷酸序列,构建TRB3-shRNA表达载体和control-shRNA阴性对照载体,宿主菌扩增,并测序鉴定。测序正确的重组质粒转染HCT-8细胞,以潮霉素筛选,分别建立稳定表达TRB3-shRNA和control-shRNA的HCT-8细胞系。通过细胞划痕-修复实验检测细胞的迁移能力。同时,通过克隆、酶切、连接、转化和扩增,构建TRB3启动子区的荧光素酶报告基因pTRB3-Luc,转染HEK293ET细胞并给予衣霉素刺激,检测荧光素酶报告基因的活性。经测序证实,TRB3-shRNA真核表达载体构建成功,插入的DNA片段与设计序列完全一致。在建立的稳定表达TRB3-shRNA的HCT-8细胞中,TRB3的mRNA和蛋白表达水平都显著下降,细胞的迁移能力显著降低。同时,TRB3启动子区荧光素酶报告基因pTRB3-Luc构建成功,并在衣霉素诱导下呈现剂量依赖性的活性增强。TRB3-shRNA重组质粒、稳定沉默TRB3的HCT-8细胞系和TRB3启动子报告基因的建立为进一步研究TRB3在肿瘤发生发展过程中的作用以及TRB3抑制剂的筛选提供了有力的工具。     

小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)启动子荧光素酶表达载体.方法 利用PCR技术扩增小鼠TNF-α启动子序列,将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中.将经过鉴定的重组载体pGL3-TNFα-promoter转染巨噬细胞264.7,应用萤光素酶检测系统检测其活性.结果 测序结果 表明,扩增的启动子序列正确.荧光素酶活性检测表明,pGL3-TNFα-promoter具启动荧光素酶基因表达的活性.结论 成功构建小鼠TNF-α启动子荧光素酶表达载体pGL3-TNFα-promoter,为进一步研究TNF-α奠定了物质基础.     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究

目的 以PRDM1基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立体外药物筛选细胞模型,并对中草药小分子化舍物进行筛选.方法 将人PRDM1基因启动子序列(267、1 257 bp)克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3-PRDM1并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映PRDM1基因启动子的启动转录活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证.结果 成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-PRDM1.用0.5、1、2、4μmol/L的5-Aza-CdR处理重组的U266细胞筛选模型,与0μmol/L 5-Aza-CdR相比,增加5-Aza-CdR的刺激,荧光强度及PRDM1基因启动子的活性呈剂量依赖性增强.与0μmol/L相比,青蒿琥酯从5 μmol/L浓度开始对PRDM1基因启动子活性呈明显降低(P＜0.05),在20 μmol/L浓度时降到最低;白芍总苷呈现小剂量促进PRDM1启动子活性,高剂量抑制PRDM1基因启动子活性.青蒿琥酯对细胞生长增殖影响较小,白芍总苷对细胞生长增殖的影响较复杂.结论 成功建立了以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型,并筛选出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因启动子活性.     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～ 1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.