细胞外基质受体α-Dystroglycan影响胸腺细胞分化发育的可能机制

目的研究细胞外基质受体alpha-Dystroglycan(α-DG)对胸腺细胞分化的影响及机制。方法摘取15日胚龄鼠胸腺小叶进行体外器官培养。将α-DG抗体、对照抗体或培养液滴加在胸腺小叶上。FACS(Fluorescence-activated cell sorting)分析胸腺细胞表面分子CD4、CD8、CD95和CD69等的表达。结果α-DG中和抗体能明显抑制胸腺细胞分化，显示胸腺双阴性细胞比例从对照组的26．5％增高到实验组的71．6％，双阳性细胞和CD8单阳性细胞比例则显著下降，分别从39．8％和20．7％下降到7．5％和6．8％，CD4单阳性细胞比例则无明显变化；同时胸腺细胞数目明显减少；CD95、CD69的表达水平随α-DG中和抗体的持续存在呈现显著升高。结论α-DG通过参与胸腺细胞的活化和凋亡活动影响胸腺细胞的发育。     

胸腺基质细胞支持下骨髓CD34~+细胞向T细胞体外定向分化

目的：研究人骨髓CD34^＋细胞体外向T细胞定向分化的方法，为研究造血细胞淋系造血活性及T细胞发育和分化提供技术平台。方法：免疫磁珠法分离骨髓CD34^＋细胞，在骨髓基质细胞条件培养液构建的微环境下，在胸腺基质细胞的支持下，使其体外向T细胞定向分化，收集培养的非贴壁细胞，免疫荧光染色后经流式细胞术检测培养不同时间CD1^-CD3^＋细胞、CD3^＋CD4^＋CD8^-细胞及CD3^＋CD4^-CD8^＋细胞比例。结果：培养1周时，培养细胞中以不成熟的CD1^＋CD3^-细胞、CD1^＋CD3^＋细胞为主，可检测到少量CD1^-CD3^＋细胞，随培养时间延长，不成熟细胞比例逐渐减少，而成熟的CD1^-CD3^＋细胞比例逐渐增加；在CD3^＋细胞中，培养初期以不成熟的双阳性细胞CD4^＋CD8^＋为主，而成熟的单阳性CD^＋CD8^-细胞及CD4^-CD8^＋细胞占极小比例，随培养时间延长，双阳性细胞比例逐渐减少，而成熟的单阳性细胞比例逐渐增高；而无胸腺基质细胞支持的CD34＋细胞仅在培养初期检测到成熟细胞存在，而培养后4周基本检测不到成熟T细胞的存在。结论：在骨髓基质细胞及胸腺基质细胞的支持下，骨髓CD34^＋细胞可体外发育为成熟的CD1^-CD3^＋细胞及单阳性T细胞，其中胸腺基质细胞的支持对于造血细胞向T细胞的体外定向分化极其重要。     

松果体及褪黑素对大鼠胸腺CD4+/CD8+T细胞分化发育的影响

目的：探讨松果体和褪黑素对胸腺T细胞分化发育的影响。方法：实验组为松果体摘除组和松果体摘除 褪黑素组。ABC法染胸腺CD4^ 、CD8^ 细胞。流式细胞术测定胸腺和血液T淋巴细胞CD4^ 、CD8^ T亚类。结果：松果体摘除后胸腺明显萎缩,并随时间延长而加剧,补充褪黑素后胸腺重量逐渐恢复。松果体摘除后胸腺和血液中CD4^ T细胞百分比无明显波动;胸腺CD8^ T细胞比例上升,但血液CD8^ T细胞比例则下降;补充褪黑素后胸腺CD4^ T细胞在低剂量组略有下降,而高剂量组则显著升高,胸腺和血液CD8^ T呈下降趋势,双阳性细胞比例恢复正常,双阴性细胞比例则上升。结论：松果体能显著影响CD8^ T细胞的分化发育和释放,降低血液CD8^ T细胞的比例。补充褪黑素能缓解相关影响。     

NF-κB诱导激酶基因突变对CD4+CD25+调节性T细胞产生的影响

目的：探讨NIK基因变异鼠—aly鼠自身免疫病的产生与CD4^ CD25^ 调节性T细胞的相关性。方法：利用NIK基因自然突变鼠—aly／aly鼠做为动物模型，aly／ 小鼠做为NIK基因正常对照鼠；CN4^ CD25^ T细胞亚群鉴定采用流式细胞分析仪(FACS)；用免疫组织化学方法观察胸腺结构。结果：aly小鼠的CD4 CD25^ CD8^-胸腺细胞数量和脾脏CD4^ CD25^ CD8^-T淋巴细胞的数量明显低于aly／ 小鼠；aly小鼠胸腺髓质缺少UEA—1阳性细胞。结论：NIK基因突变的aly小鼠CD4^ CD25^ 胸腺细胞和脾脏T淋巴细胞的数量明显降低可能是aly小鼠自身免疫病产生的原因；UEA—1阳性细胞很可能在CN4^ CD25^ 调节性T细胞选择中发挥作用。     

抗鼠T细胞受体抗体抑制胸腺细胞的迁出

目的 通过检测抗仓鼠T细胞受体抗体对胸腺T细胞输出的影响，进一步研究胸腺是提供外周免疫细胞输出的有关机理。方法 体内注射抗TCR抗体48h后FACS分析新迁出细胞在胸腺、淋巴结的表达。结果 小鼠成熟髓质区高表达T细胞受体的单阳性细胞数目成倍增加，同时皮质区低表达T细胞受体的不成熟双阳性细胞数目减少。成熟的单阳性胸腺细胞高表达归巢受体L-Selectin，表型分析(TCRαβ、CD69、HAS、Vβ7-integrin、Qa-2)显示增加的这群细胞为胸腺的新迁出细胞，此群成熟细胞的高表达，表明胸腺的细胞迁出受到了抑制。胸腺内注射异硫氰酸荧光素16h后，抗TCR抗体注射小鼠外周淋巴结及脾脏CD4^ 、CD8^ 新迁出细胞数量减少。结论 抗TCR抗体能抑制胸腺T细胞向外周迁移。     

TCR抗体诱导不成熟胸腺细胞亚群凋亡的敏感性研究

为比较小鼠不同胸腺细胞亚群对抗TCR抗体诱导凋亡的敏感性，用体外抗TCR抗体刺激分离胸腺细胞．BALB／c小鼠体内注射抗TCR抗体，FACS检测胸腺细胞。结果显示，CD4^ CD8^ DP胸腺细胞和CD4^-CD8^ CD3^-TCR-细胞对抗TCR抗体诱导的凋亡敏感，但CD4^-CD8^-CD3^-TCR-胸腺前体细胞自发凋亡率低，且抗TCR抗体诱导的凋亡．表明胸腺细胞对凋亡的敏感点产生于CD4^-CD8^ CD3^-TCR-细胞表达后，胸腺细胞的凋亡敏感性受发育调节。     

年龄、性别在幼鼠胸腺T细胞增殖中的作用

目的：分析年幼小鼠性别、年龄与CD3、CD4、CD8免疫参数表达的关系。方法：分离3—9周小鼠胸腺、脾脏T淋巴细胞，FACS分析细胞表面CD3、CD4、CD8的表达；CFSE标记后细胞，加入ConA、抗TCR抗体、PMA IONO刺激剂培养72小时，流式细胞仪分析的方法比较不同刺激剂作用下雌、雄小鼠T细胞的增殖。结果：结果胸腺和脾脏表面CD3、CD4、CD8的表达与性别无明显关系，6-9周小鼠脾脏CD3^ 细胞明显多于3—4周小鼠；胸腺细胞的增殖与年龄、性别无关，而3周雌性小鼠脾细胞对PMA IONO刺激后的增殖应答比雄性明显，4-6周雄性小鼠脾细胞的增殖能力强于雌性小鼠，7—8周雌性小鼠脾细胞对抗TCR抗体的应答能力明显减小。结论：免疫系统的雌雄异型可能早于青春期。     

CD3^—CD4^—CD8^＋小鼠胸腺细胞表型的研究

目的 分析CD3^－CD4^－CD8^＋胸腺细胞的表型特征,阐明其在胸腺发育中所处地位。方法 分离纯化小鼠CD4^－CD8^＋单阳性胸腺细胞,进行CD3与其他表面标志的染色,然后进行FACS分析。结果 CD3^－CD4^－CD8^＋细胞体积较大,对可的松敏感,TGRαβ阴笥,高度表达不成熟标志6C10和HSA,不表达活化标志CD69和成熟标志Qa-2。结论 CD4^－CD8^＋单阳性胸腺细胞可明显分为CD3^＋和CD3^－两个亚群,后者代表了胸腺发育过程中由CD4^－CD8^－双阴性细胞向CD4^＋CD8^＋双阳性细胞转变的过渡状态。     

快速老化小鼠胸腺细胞分化与Notch信号相关基因表达关系的研究

目的：研究快速老化小鼠（Senescence-accelerated mice，SAM）增龄过程中胸腺T细胞亚群的变化与Notch 1、Presenilin 1、2（PS1、2）、HES1等Notch信号转导通路相关基因mRNA表达变化及这两种变化的关系。方法：选择出生后1—8周龄SAM，采用流式细胞技术检测胸腺细胞亚群变化、用荧光实时定量PCR的方法检测Notch1、PS1、PS2、HES1基因mRNA表达的动态变化。结果：SAM出生1-2周，胸腺中CD4^＋CD8^＋细胞所占比例较高，4周龄后逐渐降低，各周龄SAMP8与SAMR1之间无显著性差异；在CD4^＋CD8^＋。细胞比例上，SAM呈增龄性增加，1—6周龄的SAMP8与SAMR1之间无显著性差异，8周龄的SAMP8低于SAMR1；在CD4^＋CD8^＋细胞比例上，SAM呈增龄性增加，4周龄后的SAMP8均明显高于SAMR1；Notch1、PS2、HES1基因mRNA表达量呈增龄性增加，各周龄SAMP8的Notch1基因表达水平高于SAMR1，4周龄后SAMP8的PS2、HES1基因表达水平高于SAMR1；PS1基因mRNA表达量呈增龄性降低，4周龄后的SAMP8低于SAMR1。结论：Notch1、PS2、HES1的表达与胸腺CD4^＋CD8^＋细胞的分化呈正相关，PS1表达与胸腺CD4^＋CD8^＋细胞的分化呈负相关。     

CD3/TCR复合物抗体诱导不成熟胸腺细胞亚群的凋亡

目的：采用AnnexinV,PI染色，流式细胞仪分析的方法、DNA琼脂糖电泳法检测不同CD3/TCR复合物抗体对小鼠胸腺T淋巴细胞亚群的促凋亡作用。方法：新鲜分离胸腺细胞，加入PMA、anti-TCR anti-CD28 mAb,anti-TCR mAb等培养20小时，AnnexinV,PI,CD4,CD8细胞染色以及TCR三染，进行FACS分析，同时抽提培养细胞DNA进行琼脂糖电泳。结果：PMA IONO诱导胸腺T细胞的凋亡作用最强，anti-TCR anti-CD28 mAb次之，anti-TCR mAb最弱。结论：AnnexinV,PI细胞染色，流式细胞仪分析的方法可以灵敏检测T淋巴细胞的凋亡；anti-TCR anti-CD28 mAb能明显增强anti-TCR mAb促不成熟的CD4^ CD8^ TCR^ 和CD4^ TCR^ 细胞的凋亡作用；不成熟T细胞经TCR与自身抗原结合的活性过程能产生克隆删除从而产生自我耐受。     

NOD小鼠胸腺细胞TCR介导的信号通路缺陷

目的 进一步研究NOD小鼠T细胞应答改变机理。方法 用抗TCR抗体、ConA激活NOD小鼠胸腺细胞，分析TCR介导的信号通路的水平。结果 与Balb／c小鼠胸腺细胞相比，抗TCR抗体诱导的增殖应答较弱，与年龄及NOD胸腺CD4^ CD8^-和CD4^-CD8^ SP细胞有关；rIL-2能部分恢复对TCR抗体应答的缺乏。NOD小鼠对PMA IONO和PMA anti—TCR-mAb应答正常，但对anti-TCRmAb IONO应答缺乏。结论 与年龄有关的NOD小鼠胸腺细胞对TCR抗体应答的缺乏与T细胞激活时上游PKC信号通路的缺乏有关。     

IL-7对胸腺T细胞及树突状细胞体外分化发育的影响

目的:探讨IL-7对胸腺T细胞及胸腺树突状细胞分化的影响。方法:摘取15～16日龄胎鼠胸腺进行体外器官培养(胚胎胸腺器官培养-FTOC),分别将细胞因子IL-7和培养基滴加在胸腺小叶上,12天后收集不同条件下经FTOC培养获得的胸腺细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子CD4、CD8、CD11c、B220、Ia等的表达,通过光学显微镜观察细胞形态,通过细胞计数检测细胞数目的变化。再将经FTOC培养获得的胸腺细胞和异源的T细胞进行混合淋巴细胞反应,通过MTT法检测T细胞的增殖情况。结果:细胞计数结果表明添加外源性IL-7组的胸腺细胞数目明显减少,流式细胞仪检测结果显示其中胸腺CD4-CD8-双阴性细胞及CD8+单阳性细胞比例有所增加,而CD4+CD8+双阳性细胞比例显著下降,CD4+单阳性细胞比例没有明显变化;此外,B细胞和树突状细胞、NK细胞数量均有不同程度的增加。结论:IL-7在胸腺T细胞及胸腺树突状细胞的分化发育中发挥重要的调节作用。     

艾滋病患者外周血CD127^＋T细胞的检测

目的探讨艾滋病患者外周血CD8^＋CD127^＋T细胞的变化情况。方法选择艾滋病患者58例和正常人18例，采用流式细胞分析方法检测CD127在CD8阳性细胞上的表达情况。结果在艾滋病患者外周血中，CD4^＋细胞比例（7．98％）明显低于正常人（53．5％），CD8^＋细胞比例（86．22％）明显高于正常人（36．02％），CD4／CD8比值（0．10）明显低于正常人（1．52），CD127^＋CD8^＋CD3^＋细胞比例（20．53％）明显低于正常人（67．85％）。结论CDl27在CD8阳性T细胞上表达的减少可能是导致艾滋病患者免疫功能缺陷的原因之一。     

CD3~-CD4~-CD8~ 小鼠胸腺细胞表型的研究

目的　分析CD3-CD4-CD8 胸腺细胞的表型特征 ,阐明其在胸腺发育中所处地位。方法　分离纯化小鼠CD4-CD8 单阳性胸腺细胞 ,进行CD3与其他表面标志的染色 ,然后进行FACS分析。结果　CD3-CD4-CD8 细胞体积较大 ,对可的松敏感 ,TCRαβ阴性 ,高度表达不成熟标志 6C10和HSA ,不表达活化标志CD6 9和成熟标志Qa 2。结论　CD4-CD8 单阳性胸腺细胞可明显分为CD3 和CD3-两个亚群 ,后者代表了胸腺发育过程中由CD4-CD8-双阴性细胞向CD4 CD8 双阳性细胞转变的过渡状态。     

鲑鱼鱼白DNA对老龄小鼠胸腺淋巴细胞构成的影响

目的：探讨外源性核酸对自然衰老小鼠CD3^ 、CD3^ CD4^ 和CD3^ CD8^ 胸腺淋巴细胞构成的影响。方法：10月龄雌性Balb/c小鼠按体质量随机分为高剂量组、低剂量组和对照组。5周后，测定胸腺脏器指数；胸腺组织切片后以Image-pro Plus专业图像分析系统（4.0版）计数胸腺细胞；采用直接免疫荧光流式细胞术检测老龄小鼠胸腺细胞CD3^ 、CD3^ CD4^ 和CD3^ CD8^ 的表达情况。结果：鲑鱼鱼白DNA提取物对小鼠的体质量、胸腺质量和胸腺指数均没有影响，但可增加小鼠的胸腺皮质和髓质细胞数量，并提高CD3^ 、CD3^ CD4^ 和CD3^ CD8^ 淋巴细胞的比例，而对CD3^ CD4^ 和CD3^ CD8^ 淋巴细胞的比值没有影响。结论：补充鲑鱼鱼白DNA可能改变自然衰老Balb/c小鼠胸腺细胞的构成，使胸腺有效细胞数量增加，从而可能延缓胸腺的退化萎缩。     

中国HIV感染者细胞毒性淋巴细胞内穿孔素的差异性表达

目的 了解中国HIV感染者细胞毒性相关的NK细胞及CD8^＋T细胞内穿孔素表达水平，探讨HIV感染过程中穿孔素表达与机体免疫功能的关系。方法 采集31例未经抗病毒治疗的HIV感染者和经过高效抗逆转录病毒疗法（HAAS）治疗的17例HIV／AIDS患者以及15例健康对照的抗凝全血，应用流式细胞仪胞内染色法检测CD56^＋／CD3^-、CD3^-／CD16^＋NK细胞及CD8^＋／CD3^＋内穿孔素表达的百分数，分析其与NK细胞绝对值、NK细胞百分数、CD4^＋T、CD8^＋T淋巴细胞绝对值及血浆病毒载量的相关性。结果 中国HIV感染者的NK细胞CD56^＋／CD3^-及CD3^-／CD16^＋亚群穿孔素表达百分数（平均13．17％，平均24．05％）高于CD8^＋T细胞穿孔素表达百分数（平均9．03％）；NK细胞内穿孔素表达低于健康对照（P〈0．05，P〈0．05），CD8^＋T细胞内穿孔素表达高于健康对照（P〈0．05）；NK细胞及CD8^＋T细胞内穿孔素表达水平与其绝对计数显著相关，与疾病进展不相关。HAART治疗组NK细胞内穿孔素表达升高，CD8T^＋细胞内穿孔素表达无显著变化。结论 中国HIV感染者NK细胞内穿孔素表达降低，抗病毒治疗后升高；CD8^＋T细胞内穿孔素表达升高，抗病毒治疗后无显著变化。     

肺癌患者CD4+CD25high Foxp3+调节性T细胞的格局变化及意义

目的：研究肺癌患者外周血（PBMC）及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中CD4^＋ CD25^high Foxp3^＋调节性T细胞（Treg）的比例改变，探讨其在抗肿瘤免疫中的调节作用。方法：分离肺癌患者PBMC及TIL，FACS分析CD4^＋／CD8^＋T细胞的比值及CD4^＋ CD25^highT细胞占CD4^＋T细胞的比例。Real-time PCR检测Treg特异性转录因子Foxp3基因在PBMC及TIL中的表达。结果：肺癌患者PBMC及TIL中CD4^＋／CD8^＋比值降低；而CD4^＋ CD25^high T细胞在CD4^＋T细胞中所占比例升高；Foxp3基因仅在TIL中高表达，而在PBMC中低或不表达，表明肿瘤局部的CD4^＋ CD25^high T细胞主要是CD4^＋ CD25^high Foxp3^＋ Treg。结合临床资料分析显示Treg在肺腺癌比例较高。结论：CD4^＋ CD25^high Foxp3^＋ Treg在肺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中明显升高，可能与其通过细胞与细胞间接触抑制CD8^＋T细胞的杀伤效应，最终发挥免疫抑制效应相关。     

miR-126基因敲减对小鼠胸腺淋巴细胞发育的影响

目的研究miR-126基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响,并初步探讨其意义。方法观察miR-126基因敲减(KD)小鼠胸腺的体积、重量和细胞总数;Real-time PCR检测小鼠胸腺miR-126表达水平;HE染色观察小鼠胸腺形态学结构;FACS检测胸腺中淋巴细胞比例、核抗原Ki-67的表达以及细胞凋亡的变化;最后,Western blot检测胸腺中磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化ERK1/2(p-ERK)的表达。结果 WT和miR-126KD小鼠胸腺体积大小、重量以及细胞总数均无明显差异,但miR-126KD小鼠胸腺miRNA-126表达水平显著下调(P0.05)。miR-126KD小鼠胸腺组织结构出现形态学异常。与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞比例及细胞绝对数明显增加(P0.05),而CD4~+CD8~+(DP)细胞比例及绝对数则显著减少(P0.05),miR-126KD小鼠胸腺CD4~+SP细胞核抗原Ki-67表达显著增加(P0.05),且细胞凋亡明显减少(P0.05),而DP细胞Ki-67表达则明显减少(P0.05)。最后,miR-126KD小鼠胸腺淋巴细胞中磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2的表达水平明显下调(P0.05)。结论 miR-126基因敲减可显著影响胸腺细胞特别是CD4~+SP细胞的发育,为后续进一步深入探讨miR-126对T淋巴细胞发育以及功能的影响提供重要的实验基础。     

CD4+ CD25+调节性T细胞对树突状细胞的杀伤作用

目的 探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞是否对树突状细胞发挥免疫调节作用及其可能的机制。方法 用MACS（magnetic cell sorting）从BALB／c小鼠静息T细胞分离纯化CD4^＋CD25^＋T细胞，体外细胞增殖实验观察其对CD4^＋CD25^＋T细胞的免疫抑制作用；GM-CSF／IL-4培养自体小鼠骨髓来源DC，FACS（fluorescence-activated cell sorting）鉴定其表面分子特性；以CD3／CD28单克隆抗体活化CD4^＋CD25^＋调节性T细胞，FACS体外杀伤实验研究其对自体DC的调节作用，并观察穿孔素抑制剂EGTA对上述作用的影响。结果 用MACS法成功分离出CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，特异性表达而Faxp3基因，能明显抑制CD4^＋CD25^＋T细胞的体外增殖；骨髓来源的DC表达CDllc、MHCⅡ及少量协同刺激分子CD80、CD86；FACS体外杀伤实验证实以CD3／CD28抗体体外活化的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对自体DC有显著杀伤作用（P〈0．05），穿孔素抑制剂EGTA能部分抑制该杀伤效应（P〈0．05）。结论 CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可通过杀伤作用对自体DC发挥免疫调节作用，穿孔素／颗粒酶杀伤途径可能参与其中。     

SLE患者外周血T细胞亚群ICOS与CD28共表达水平与疾病的关系

目的观察系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)病人外周血CD4^ 及CD8^ T细胞表面可诱导共刺激分子(inducible co-stimulator，ICOS)及CD28共表达水平，探讨ICOS和CD28共表达水平与SLE疾病的关系。方法采用三色流式细胞术检测SLE病人(n=51)及正常人(n=30)外周血CD4^ 及CD8^ T细胞表面ICOS与CD28共表达水平，并结合SLE病人疾病活动程度、临床表现等进行分析。结果与正常人相比，SLE活动期和稳定期病人外周血CD4^ T细胞中仅表达ICOS不表达CD28(即CD28^-ICOS^ )的细胞比例明显升高，但活动期病人和稳定期病人之间并无差异；活动期病人外周血CD8^ T细胞上同时表达CD28和ICOS的细胞(即CD28^ ICOS^ 细胞)和CD28^-ICOS^ 细胞比例都明显升高；同一SLE病人在疾病活动期CD4^ 和CD8^ T细胞中CD28^ ICOS^ 的细胞比例和CD8^ T细胞中CD28-ICOS^ 细胞比例明显高于该病人经过治疗病情稳定时；初发未治疗SLE病人仅CD4^ T细胞中CD28^ ICOS^ 细胞的比例比复发病人明显升高；血清抗dsDNA抗体( )病人和血清免疫球蛋白含量(IsG、IgA和IgM中任何一种)异常升高的病人外周血CD4^ T细胞中CD28^ ICOS^ 细胞和CD8^ T细胞中CD28-ICOS^ 细胞比例分别明显高于血清抗dsDNA抗体(-)和血清免疫球蛋白含量正常的病人。结论CD28和ICOS在SLE病人外周血CD4^ 和CD8^ T细胞上共表达水平与SLE疾病的活动程度、病程及临床表现等存在一定的关联。