HSP70基因转染对缺氧-再复氧肠上皮细胞生长能力影响的研究

目的 :研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对缺氧再复氧损伤后肠上皮细胞生长能力的影响。方法 :将重组含人全长 HSP70基因的腺病毒转染体外培养的肠上皮细胞株 IEC 6 ,检测转染细胞 HSP70的 m RNA表达水平。 IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,对未转染组 ,转染 2 4 h、4 8h及 72 h组细胞的细胞活力、生长曲线、增殖能力进行检测分析。结果 :腺病毒转染组细胞 HSP70 m RNA表达呈阳性。经缺氧再复氧处理后 ,IEC 6转染细胞活力较未转染组活力明显增强 (P<0 .0 1) ,生长能力提高 (P<0 .0 5 ) ,分裂指数增高(P<0 .0 5 )。结论 :重组腺病毒介导的 HSP70转染可增强肠上皮细胞生长及增殖能力 ,从而保护其抵抗缺氧再复氧损伤。     

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧/复氧心肌细胞的影响

目的:观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)对缺氧/复氧新生大鼠心肌细胞的保护作用.方法:无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠MSC,细胞融合达90%时更换培养基培养24 h,收集细胞培养液作为MSC条件培养基;原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞,先用5% CO2、10% H2、85% N2混合气造成细胞缺氧24 h,再给予95% O2 和 5% CO2混合气复氧2 h,建立缺氧/复氧模型.MSC 处理组于复氧时加入MSC 条件培养基,正常细胞作为对照组,分别于复氧后用MTT法、乳酸脱氢酶(lactated dehydrogenase)法测定各组心肌细胞活性的改变;RT-PCR观察细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果: 与对照组比较,缺氧/复氧组细胞活力显著降低(P ＜ 0.01).与缺氧/复氧组比较,MSC处理组细胞活力明显增加(P ＜ 0.01).缺氧/复氧组抗凋亡基因Bcl-2的表达明显降低,促凋亡基因Bax的表达明显增加,而MSC条件培养基可以减少Bax基因的表达,提高Bcl-2/Bax值,与缺氧/复氧组比较差异具有显著性(P ＜ 0.01).结论:MSC对体外缺氧-复氧诱导的心肌细胞的凋亡有保护作用.     

基因疗法治疗骨骼、肌肉组织缺损的基础研究:重组复制缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β_1的构建

目的构建重组缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1。方法利用同源重组的原理,将含有TGF-β1基因cDNA的pACCMVTGF-β1质粒和pJM17质粒在腺病毒包装细胞中共转染,制备重组复制缺陷腺病毒Ad5/CMV-TGF-β1并进行鉴定。结果采用同源重组的方法获得的重组复制缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1稳定、滴度高(5～10×107pfu/ml)。结论重组缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1的构建成功,为下一步进行基因疗法治疗骨骼、肌肉组织缺损提供基础。     

基因疗法治疗骨骼、肌肉组织缺损的基础研究 : 重组复制缺陷型腺病毒载体 Ad5/CMV-TGF-β1的构建

目的构建重组缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1.方法利用同源重组的原理,将含有TGF-β1基因cDNA的pACCMVTGF-β1质粒和pJM17质粒在腺病毒包装细胞中共转染,制备重组复制缺陷腺病毒Ad5/CMV-TGF-β1并进行鉴定.结果采用同源重组的方法获得的重组复制缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1稳定、滴度高(5～10×107pfu/ml).结论重组缺陷型腺病毒载体Ad5/CMV-TGF-β1的构建成功,为下一步进行基因疗法治疗骨骼、肌肉组织缺损提供基础.     

腺病毒介导的热休克蛋白70在神经元和胶质细胞中的抗缺氧研究

目的 探讨重组腺病毒介导的热休克蛋白70(HSP70)表达对神经元和胶质细胞缺氧/再复氧损伤的保护作用.方法 制备携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70.感染体外培养的神经元和胶质细胞,检测靶细胞中外源性HSP70的表达.感染vAd-HSP70 24、48、72 h组和感染vAd-GFP对照组的细胞经缺氧/再复氧处理后,分别测定细胞活性、细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性及线粒体和胞质内细胞色素C含量.结果 感染vAd-HSP70的神经细胞可检测到外源性HSP70基因表达.经缺氧/再复氧处理,感染vAd-HSP70组细胞活性较感染vAd-GFP对照组明显增强(P均＜0.05);感染vAd-HSP70 24、48、72 h组细胞培养上清液中LDH活性[(1 480±121)、(1 023士106)、(1 132±197)U/L]均明显低于感染vAd-GFP对照组[(1 976±190)U/L],线粒体中细胞色素C含量(0.986±0.012、1.028±0.007、1.014±0.008)均明显高于感染vAd-GFP对照组(0.970±0.003),而胞质中的细胞色素C含量(0.987±0.008、0.960±0.005、0.964±0.003)则低于感染vAd-GFP对照组(1.011±0.005,P＜0.05或P＜0.01),其中以感染48 h最为理想(P均＜0.01).结论 腺病毒介导的外源性HSP70表达可保护神经元和胶质细胞抵抗缺氧/再复氧损伤,具有明确的细胞保护作用.     

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管内皮细胞的作用

目的：研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子（HGF）基因感染血管内皮细胞后在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧的情况下细胞的凋亡情况。方法：将分离、培养的内皮细胞分为3组，分别给予M199（对照组）、HGF（HGF组）和HGF基因腺病毒载体（Ad-HGF组），分别在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧3种情况下观察细胞的凋亡情况。结果：Ad-HGF组及HGF组细胞凋亡数均低于对照组（P〈0．01），Ad-HGF组与HGF组细胞凋亡数差异无显著性意义。结论：腺病毒载体介导HGF基因感染内皮细胞后能在缺氧情况下有效地阻止细胞凋亡。     

研究Cyp2j3基因对H9C2大鼠心肌细胞保护作用以及相关机制

目的探讨Cyp2j3基因通过STAT3信号通路对H9C2心肌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 H9C2大鼠心肌细胞分为正常对照组(对照组,常氧条件下培养)、pc DNA3.1组(转染空载体pcDNA3.1)、单纯缺氧复氧组(I/R+pcDNA3.1组,转染pc DNA3.1后,缺氧10 h后复氧2 h)和单纯缺氧复氧+pc DNA3.1-Cyp2j3组转染Cyp2j3的过表达载体后,缺氧10 h后复氧2 h)。Western bloting检测过表达Cyp2j3的效果;噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞的LDH活性;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;Western bloting检测增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及信号转导与转录因子3(STAT3)信号通路STAT3和磷酸化的STAT3的蛋白表达。结果转染pc DNA3.1-Cyp2j3后的H9C2细胞Cyp2j3的蛋白表达显著升高;I/R+pc DNA3.1组和I/R+pcDNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和pSTAT3的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著高于pcDNA3.1组(P0.05),而I/R+pc DNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达均显著高于I/R+pc DNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著低于I/R+pcDNA3.1组(P0.05)。结论过表达Cyp2j3基因可通过激活STAT3信号减弱缺氧复氧引起的H9C2细胞增殖降低、LDH活性和凋亡增加,从而对心肌细胞起保护作用。     

重组腺病毒介导RECK基因在大肠癌细胞中的表达及抑制癌细胞浸润能力的实验研究

目的　研究重组腺病毒介导RECK基因转染大肠癌细胞后基因的表达情况,并观察转染细胞浸润能力变化。方法　构建了RECK基因的复制缺陷型重组腺病毒载体adRECK ,以adRECK转染大肠癌癌细胞株后,用RT PCR法检测RECK基因在大肠癌中的表达。并用Boyden小室测试转染细胞的侵袭性。结果　RECK基因在转染细胞中有效的表达。被转染细胞浸润能力明显下降。结论　重组腺病毒介导RECK基因能够在大肠癌细胞中有效的表达,转染病毒的大肠癌浸润能力明显下降。     

TLR4基因小干扰RNA对缺氧复氧诱导BV-2细胞炎症因子分泌的影响

目的 研究Toll样受体4(TLR4)基因小干扰RNA(siRNA)对体外缺氧复氧条件下诱导BV-2细胞分泌TNF-α的抑制作用.方法 小鼠小胶质细胞株BV-2置于六扎培养板培养,随机分为N组(正常培养组)、H组(缺氧复氧组)、T组(缺氧复氧+TLR4-siRNA转染组,转染质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA)、C组(缺氧复氧+对照siRNA转染组,转染含对照序列的质粒pEGFP-H1/对照-siR-NA)和B组(缺氧复氧+空白质粒转染组,转染pEGFP-H1空质粒)共5组.其中H组、T组、C组和B组细胞缺氧培养3 h后复氧培养24 h,运用脂质体转染技术介导质粒转染,流式细胞术检测转染后BV-2细胞EGFP的表达率,RT-PCR方法检测各组BV-2细胞TLR4 mRNA和NF-кB p65 mRNA的表达水平,Western blot方法检测各组BV-2细胞TLR4蛋白表达变化,ELISA方法检测各组上清液中TNF-α含量.采用方差分析进行统计分析.结果 转染后BV-2细胞EGFP的表达率为(67.58±7.16)%;经缺氧复氧处理后,H组、T组、C组和B绀的TLR4 mRNA、NF-кB p65 mRNA、TLR4蛋白水平较N组均明显上调(P＜0.01),各组卜清液TNF-α含量较N组也明显升高(P＜0.01);而T组TLP4 mRNA、NF-кBp65 mRNA、TLR4蛋白表达量和上清液TNF-α含量较H组、C组和B组均明显下凋(P＜0.01);C组和B组分别与H组相比,各项检测指标表达均无明显变化(P＞0.05).结论 针对TLR4 mRNA的小干扰RNA可以有效的抑制缺氧复氧诱导的BV-2细胞的炎症反应.     

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白对缺氧/复氧肾小管上皮HK-2细胞自噬作用的影响

摘要：目的：观察中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）对缺氧/复氧肾小管上皮细胞HK-2自噬水平的影响,探讨NGAL在肾小管上皮细胞缺氧/复氧过程中发挥的作用。 方法：构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,并转染HK-2细胞。将HK-2细胞分为未转染组和转染组,每组再分为缺氧/复氧处理组和未处理组。用western blot法检测转染后NGAL蛋白表达水平和缺氧/复氧后细胞自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC-3-Ⅱ）表达水平,并用CellTiter Blue细胞活性检测系统检测细胞活力。 结果：成功构建高表达NGAL的载体pcDNA3.1(-)/myc-His B-NGAL,转染HK-2细胞后,细胞NGAL蛋白表达水平高于未转染组（t=8.959,P<0.05）。缺氧1 h/复氧24 h后,转染组细胞LC-3-Ⅱ表达水平高于未转染组（t=21.721,P<0.05）,而细胞活力低于未转染组（t=－6.238,P<0.05）。 结论：在HK-2细胞缺氧/复氧状态下,NGAL能增强细胞自噬水平,导致细胞损伤加重甚至死亡。     

人核小体结合蛋白1小分子干扰RNA重组慢病毒抑制非激素依赖性前列腺癌体内生长的实验研究

目的探讨重组慢病毒介导的人核小体结合蛋白1（NSBP1）基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145移植瘤生长的抑制作用及机制。方法慢病毒lentivirus-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145。用转染细胞成瘤,观察抑瘤效果。运用实时RT-PCR和Western blot方法检测移植瘤中NSBP1、cyclinB1与Bcl-2的mRNA和蛋白的表达。结果体内实验证实NSBP1表达水平的降低,对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。同时随着NSBP1表达水平的降低,cyclinB1和Bcl-2的mRNA及蛋白的表达也降低。结论NSBP1-RNAi-lentivirus重组慢病毒能有效抑制DU145细胞移植瘤的生长,NSBP1可能通过调控cyclinB1、Bcl-2基因的变化影响肿瘤细胞的生长。     

bcl-2、bax在NHE-1核酶基因转染所致缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡中的作用

目的　探讨 bcl 2、bax表达在 Na / H 交换器 1(NHE 1)抑制而诱导缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)凋亡中的作用。方法　将转染 NHE 1特异性核酶基因大鼠的 PASMCs置于缺氧条件下(O2 的体积分数 <1% )培养 ,分别在缺氧 0、2、6、12、2 4和 4 8h采用原位细胞凋亡检测法观察细胞凋亡情况 ,荧光指示剂 Fura 2 / AM测定法检测细胞内 Ca2 浓度 (〔 Ca2 〕i)变化 ,半定量逆转录聚合酶链反应方法检测细胞内 bcl 2 m RNA和 bax m RNA表达变化 ,免疫组化法检测细胞内 Bcl 2蛋白和 Bax蛋白表达的变化。结果　转染 NHE 1特异性核酶基因大鼠的 PASMCs在缺氧培养时 ,其细胞凋亡率随缺氧时间的延长而逐渐升高 ,但是〔 Ca2 〕i升高的幅度较小 ,从缺氧 6 h起就显著低于同时间点的对照组和转染逆转录病毒真核表达载体空载体组 (P均 <0 .0 1) ,bcl 2 m RNA及蛋白表达显著降低 ,bax m RNA和蛋白表达显著增加(P均 <0 .0 1)。结论　 NHE 1抑制可能通过阻止 PASMCs的〔 Ca2 〕i增加 ,并引起 bcl 2表达降低及 bax表达增加而诱导和促进缺氧培养的 PASMCs凋亡     

基因bcl-2对神经元生物活性的保护作用

目的研究基因bcl-2对神经元的生物活性作用,为神经系统疾病的保护治疗提供有效的途径。方法构建真核表达载体pcDNA3-bcl-2,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞,WesternBlot检测外源基因表达;10,50和100μmol/L顺铂处理转染重组质粒的实验A组细胞,同样条件处理转染空质粒的对照B组细胞,72h后比较两者存活的细胞数;流式细胞仪检测分析两者的细胞周期指数。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3-bcl-2,并用脂质体介导的方法获得了稳定表达Bcl-2的细胞克隆;10,50和100μmol/L顺铂处理后,实验A组存活的细胞数分别为276±13,185±11和108±10,而对照B组中存活的细胞数分别为100±9,12±3和2±2,两者相比差异有显著性意义;流式细胞仪检测显示,实验A组S期细胞所占百分比为8.81%比对照B组25.79%明显减少(χ2=22.53,P<0.01)。结论bcl-2能够拮抗顺铂对神经元的损害作用,促进神经细胞存活,其神经保护作用机制可能通过调控细胞周期来完成。     

大鼠组织因子基因克隆及其在C6细胞系中的表达

目的:克隆大鼠组织因子(tissue factor,TF)基因,构建真核表达载体pEGFP-N1-TF,转染C6大鼠神经胶质瘤细胞并检测转染细胞内TF表达水平.方法:采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织中扩增TF基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1上.通过测序鉴定重组质粒中插入TF的完整性和可靠性.应用脂质体法将鉴定正确的重组质粒转入C6细胞中,荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率,并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测.结果:成功构建pEGFP-N1-TF真核表达载体,转染C6细胞24 h后,在荧光显微镜下可以观测到荧光,并通过Western blot技术检测到TF-eGFP融合蛋白的表达.结论:重组真核表达载体pEGFP-N1-TF构建成功,转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达.     

小发夹RNA对白血病K562细胞血管内皮生长因子受体Fit-1基因表达的抑制作用

本研究观察小发夹RNA对白血病细胞血管内皮生长N子受体flt-1基因表达的抑制作用并探讨其对白血病细胞侵袭能力的影响及作用机制。采用脂质体介导的方法将构建的人flt-1基N特异性shRNA真核表达载体转染入K562细胞,用（3418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组DNA,用PCR方法验证shRNA基因对K562细胞的转染;以RT—PCR和免疫印迹反应检测flt-1mRNA和蛋白表达量的变化;用Boyden小室体外侵袭实验检测白血病细胞的侵袭能力;RT～PCR方法检测白血病细胞MMP-2和MMP-9的表达。结果表明,flt-1基因特异性shRNA真核表达载体转染入白血病细胞株K562,G418筛选2周获得阳性克隆;PCR检测证实shRNA基因整合入白血病细胞基因DNA;携有shRNA的flt-1基因能明显下调白血病细胞内flt-1基因mRNA表达水平;设计的2种不同flt-1shRNA序列能不同程度干扰flt—1基因和蛋白在细胞中的表达,两纽阳性细胞中flt-1基因表达抑制率分别为46．1％和65．4％;flt—1 shRNA转染白血病细胞系K562细胞后,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均较转染前明显下降;阳性细胞穿透人工重组基底膜的能力（4．3±1．2）％较对照组（12．7±1．9）％及（9．6±1．7）％明显降低（P〈0．01）。结论：VEGF受体flt-1特异性shRNA的真核表达载体能够高效转染入白血病细胞株K562,有效抑制flt-1基因的表达,并使白血病细胞体外侵袭能力减弱,MMP-2和MMP-9mRNA表达水平下降。这提示VEGF可能通过与其受体结合调控MMP-2和MMP-9的方式,参与白血病细胞的转移。     

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16.1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达.方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4 DNA Ligase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果.结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达.结论:成功构建真核表达质粒DENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制.     

Na+/H+交换器-1抑制诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的可能机制

背景肺动脉平滑肌细胞( pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)的增殖在缺氧肺动脉高压肺血管重构中起重要作用.解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸研究所在前期实验中通过构建 Na+ /H+交换器- 1( sodium/proton exchanger isoform-1, Na+ /H+ exchanger isoform-1, Na+ /H+ antiporter isoform-1, NHE-1)特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,发现 NHE-1抑制可诱导细胞内酸化而抑制 PASMC增殖,并促进其凋亡.但这种促凋亡作用是通过什么途径来完成,尚不清楚.目的探讨 Bcl-2、 Bax蛋白表达在 NHE-1抑制而诱导大鼠 PASMC凋亡中的作用.设计分组对照实验.地点和材料实验在解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所完成.转染表达 NHE-1特异性核酶基因的体外培养大鼠 PASMC( PRZ细胞)、转染 PLXSN空载体的大鼠 PASMC( PX细胞)、未处理大鼠 PASMC细胞( PA细胞)为前期实验所制备.干预已构建 NHE-1特异性核酶基因逆转录病毒载体,转染入体外培养的大鼠 PASMC内表达,同时转染 pLXSN空载体入另一组大鼠 PASMC内,后者与未转染的大鼠 PASMC细胞为对照组.用荧光指示剂( Fura-2/AM)测定法检测转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化; RT-PCR方法检测细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化,免疫组化法检测细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.主要观察指标①转染 NHE-1特异性核酶基因的大鼠 PASMC内 Ca2+( [Ca2+ ]i)变化.②细胞内 Bcl-2和 Bax mRNA表达变化.③细胞内 Bcl-2和 Bax蛋白表达变化.结果转染 NHE-1特异性核酶基因后,大鼠 PASMC内 [Ca2+ ]i显著升高,细胞内 [Ca2+ ]i在 PA细胞 [(95.94± 6.39) nmol/L]与 PX细胞 [(98.08± 7.37) nmol/L]之间差异无显著性意义( P 》0.05),而 PRZ细胞 [(198.08± 16.59) nmol/L]显著高于 PA细胞及 PX细胞 , 差异有显著性意义( P《 0.001).Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的平均积分光密度分别为 2.21± 0.18, 2.09± 0.30, 1.45± 0.20), Bax mRNA和蛋白表达显著增加( PA细胞、 PX细胞、 PRZ细胞的 ABax/Aβ-actin分别为 0.17± 0.02, 0.23± 0.06, 0.59± 0.08).结论 NHE-1抑制诱导的 PASMC凋亡与 [Ca2+ ]i增加、 Bcl-2表达降低及 Bax表达增加有关.     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains1,LRIG1）基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的LRIG1mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negativeshRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1（LRIG11）细胞和pGenesil2-LRIG1-shRNA2（LRIG12）细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negativeshRNA分别下降47.9%（P〈0.01）和32.8%（P〉0.05）。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。