HSP70基因转染对缺氧-再复氧肠上皮细胞生长能力影响的研究

目的 :研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对缺氧再复氧损伤后肠上皮细胞生长能力的影响。方法 :将重组含人全长 HSP70基因的腺病毒转染体外培养的肠上皮细胞株 IEC 6 ,检测转染细胞 HSP70的 m RNA表达水平。 IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,对未转染组 ,转染 2 4 h、4 8h及 72 h组细胞的细胞活力、生长曲线、增殖能力进行检测分析。结果 :腺病毒转染组细胞 HSP70 m RNA表达呈阳性。经缺氧再复氧处理后 ,IEC 6转染细胞活力较未转染组活力明显增强 (P<0 .0 1) ,生长能力提高 (P<0 .0 5 ) ,分裂指数增高(P<0 .0 5 )。结论 :重组腺病毒介导的 HSP70转染可增强肠上皮细胞生长及增殖能力 ,从而保护其抵抗缺氧再复氧损伤。     

重组腺病毒AdmIL-12对树突状细胞的基因转染

目的：应用重组腺病毒AdmIL-12转染树突状细胞（DC）制备DC疫苗。方法：以重组腺病毒AdmIL-12转染DC后,用流式细胞仪检测DC的表型,用RT-PCR检测IL-12在DC内的表达,用EILSA法测定细胞培养上清液中的mIL-12和mIFN-γ的含量。通过IL-12刺激T细胞分泌IFN-γ的能力以检测DC分泌的IL-12的生物活性。结果：重组腺病毒AdmIL-12能高效转染DC,转染后DC的表型无显著改变,转染DC能大量分泌具有生物活性的IL-12。结论：腺病毒AdmIL-12成功转染DC,获得有效的DC疫苗。     

Bcl-2与细胞凋亡

Bcl－2基因是一原癌基因,能抑制细胞凋亡。但近年研究友现,存在有Bcl－2敏感和不敏感的细胞凋亡现象。Bcl-2抑制细胞凋亡的机制目前仍然不清,大多认为与Bcl－2的细胞内抗氧化作用及抑制钙离子的跨膜运动有关。最近,Reed提出Bcl-2具有离子通道蛋白和吸附／锚定蛋白的双重特性,并阐述了Bcl-2抑制细胞凋亡的某些机制。     

脑源性神经营养因子基因重组腺病毒体外转染胚胎大鼠神经干细胞及其鉴定

目的：以脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）基因重组腺病毒体外转染神经干细胞,建立能稳定表达BDNF的神经干细胞系,为下一步的动物实验提供材料。方法：（1）分离SD 大鼠胎鼠的间脑,加入神经生长因子表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在神经干细胞条件培养基中克隆培养。用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。（2）用BDNF基因重组腺病毒转染神经干细胞,并通过RT-PCR和Western-blot实验检测外源性BDNF基因的表达。结果：（1）分离培养出了大量具有不断增殖能力、表达神经巢蛋白的神经干细胞,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞。（2）60%～70%的神经干细胞感染BDNF基因重组腺病毒,Western-blot及RT-PCR实验显示BDNF大量表达。结论：本试验成功建立了神经干细胞的分离培养方法及能长期稳定表达BDNF的神经干细胞系。[著者文摘]     

腺病毒介导骨形态蛋白9基因转染免脂肪干细胞

背景:已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少.目的:探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用.设计、时间及地点:细胞摹因学体外观察,于2007-08/2008-08在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成.材料:新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供.携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠.方法:取兔颁后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞.取生长良好的第3代细胞,以1×108 L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪于细胞,并设立未转染对照组.主要观察指标:细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜索红染色测定转染后成骨活性.结果:转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节:未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成.与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长.脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12 h后即有荧光表达,转染3,6,9,12 d后人骨形态蛋白9 mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性.转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达.结论:携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用.     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌的实验研究

目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,CCK-8法检测其对细胞的毒性。结果:随着MOI增高,转染效率增高。MOI=100时Ad-GFP对HASMCs的感染效率可达(96±0.32)%,以感染后48h达高峰,持续7d仍有绿色荧光表达;转染后的细胞与未转染细胞相比,细胞毒性无统计学差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因Ad-GFP能高效转染HASMCs,转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。     

腺病毒介导AT2R基因转染表达抑制肾间质纤维母细胞增殖

目的：探讨人肾间质纤维母细胞（hRIF)转染表达血管紧张肽Ⅱ（AngⅡ)受体（AT2R）对其增殖的影响。方法：构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染hRIF,用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,用细胞周期分析,分裂指数,MTT比色法和5－溴尿苷（BrdU)掺入法检测hRIF增殖,结果：构建的AdCMV-AT2R体外转染培养hRIF表达率为90．6％,AT2R峰值表达时,其S期和G2－M期细胞比率从31．7％降低到13．9％（P＜0．05）,分裂指数从37．4％降低到9．6％（P＜0．01）,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低60．1％和54．2％（P＜0．01）,结论：AT2R转染表达可显著抑制体外培养hRIF的增殖,这一作用对肾间质纤维化的防治有益。     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景:骨形态发生蛋白2是诱导成骨关键物质,参与调节从细胞增殖、决定种系分化方向到细胞死亡等一系列的生物过程。目的:利用AdMax系统构建人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法:以人cDNA为模板PCR扩增人骨形态发生蛋白2基因,转化E.coli感受态细胞,经菌落PCR鉴定阳性转化子、阳性克隆测序无误后,扩增、抽提。将带有目的基因的腺病毒表达载体和携带有腺病毒大部分基因的辅助包装质粒共转染293细胞进行病毒包装扩增,PCR检测目的基因、Western Blot检测目的蛋白及终点稀释法检测病毒滴度。结果与结论:PCR获得长度为1223bp的人骨形态发生蛋白2目的基因片段,同源重组表达载体经阳性克隆PCR及测序鉴定,结果正确。293细胞内包装、扩增,经Westernblot及PCR鉴定无误后,获得病毒滴度为5×1013pfu/L的重组腺病毒。实验成功构建携带有人骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒载体。     

逆转录病毒载体介导的人IL—2基因转染白血病细胞的初步研究

应用逆转录病毒载体ＬＮＣＩＬ－２介导答ＩＬ－２基因转染人白血病细胞株Ｋ５６２,ＨＬ－６０,并获得稳定表达;观察到转染ＩＬ－２基因后的Ｋ５６２,ＨＬ－６０细胞,的生长速度明显落后于未转该基因或转染突载体的Ｋ５６２,ＨＬ－６０细胞。     

药物预适应对各部位心肌细胞缺氧再复氧的保护作用

目的：分析硝酸酯类药物预适应对不同部位的心肌细胞缺氧再复氧的保护作用。 方法：实验于2003-05／2005-09在泰山医学院中心实验室完成。取新生的Wistar大鼠100只，无菌取出心脏，培养不同部位的心肌细胞（心房、左心室、右心室），分为4组：①空白对照组：不作任何处理。②单纯缺氧／再复氧组：在含有体积分数为0．95的N2、0．03的CO2和0．02的O2混合气体的缺氧培养箱内孵育2h，正常培养箱内孵育1h。③L-精氨酸处理＋缺氧／再复氧组：先用10mmol／L L-精氨酸处理细胞2h，然后进行缺氧再复氧。④缺氧预适应组：先将细胞缺氧15min，再复氧15min，循环4次，然后进行缺氧再复氧。观察各组细胞坏死率、细胞凋亡情况、培养液中乳酸脱氢酶浓度及细胞内游离钙离子浓度等。 结果：①单纯缺氧／再复氧组不同部位的细胞坏死率、培养液中乳酸脱氢酶释放量及胞内钙离子浓度均显著高于空白对照组（P〈0．01），不同部位间比较差异无显著性意义（P〉0．05）。②缺氧预适应组、L-精氨酸处理＋缺氧／再复氧组不同部位的细胞坏死率、培养液中乳酸脱氢酶释放量及胞内钙离子浓度均显著低于单纯缺氧／再复氧组（P〈0．05）。 结论：L-精氨酸的预适应同经典的缺氧预适应一样，可以对缺氧再复氧损伤产生明显的保护作用，其可能是通过降低心肌细胞内钙离子的浓度来发挥作用的，而不同部位的心肌细胞产生药物预适应的能力无明显差别。     

凋亡抑制基因Bcl—2在前列腺中的表达

目的 了解前列腺组织中Bcl-2蛋白的表达。方法采用免疫组化技术，检测11例胎儿、27例成人和60例增生前列腺中Bcl-2蛋白的表达。结果胎儿前列腺Bcl-2蛋白的表达于全部胚芽上皮细胞；成人前列腺Bcl-2蛋白的表达主要定位于腺上皮基底细胞，分泌细胞偶见阳性表达；增生前列腺Bcl-2阳性表达主要定位于腺上皮基底细胞，分泌细胞也见不同程度阳性表达；增生前列腺基底细胞、分泌细胞Bcl-2阳性表达均高于正常前列腺，差异有显著性；正常前列腺与增生前列腺上皮基底细胞Bcl-2阳性表达均高于分泌上皮细胞，差异有显著性。结论基底细胞层可能为成人前列腺的干细胞层，参与前列腺的生长与增殖；Bcl-2基因蛋白可能在调节前列腺上皮的凋亡中具有重要作用；Bcl-2基因蛋白在前列腺基底细胞增生中起主要作用，而在分泌细胞中不占主要地位。     

人骨肉瘤中Bcl-2基因表达的初步研究

目的:探讨Bcl-2基因在人骨肉瘤、正常骨中表达的生物学意义。方法:采用免疫组织化学S-P法,对30例新鲜人骨肉瘤和15例正常骨进行研究。结果:正常骨组的阳性表达率为20％（3/15）,其中弱阳性1例,强阳性2例;骨肉瘤组的阳性表达率为70％（21/30）,其中弱阳性11例,中度阳性6例,强阳性4例。比较两组的染色阳性率和染色强度,差异有显著性（P<0.05）。结论:提示骨肉瘤发生与凋亡异常有关。     

泪腺上皮细胞凋亡与丙酸睾酮的抑制效应

目的:分析丙酸睾酮抑制泪腺上皮细胞凋亡的机制,为干眼症的性激素防治提供科学的理论依据。方法:实验于2003-09/2004-01在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成。①实验材料:二三月龄新西兰健康白色家兔30只,无眼疾,雌性,体质量1.5～2.5kg。丙酸睾酮(产品批号:020902,上海通用药业股份有限公司产品),用DMSO配成储存液,-70℃保存。分析纯过氧化氢购自北方同正生物技术发展有限公司。②实验方法:经耳缘静脉注射空气处死家兔,按常规无菌操作行泪腺摘除术,酶消化法分离兔泪腺上皮细胞。取二三代培养的泪腺上皮细胞,按约1×108L-1密度接种于预置小玻片的24孔板内,培养4d后,加入浓度为1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol/L丙酸睾酮,继续培养24h,另以未加丙酸睾酮的培养液培养的同期传代的泪腺上皮细胞作空白对照。培养24h后,再分别加入终浓度为100μmol/LH2O2于不同浓度丙酸睾酮组继续培养60min,另以未加丙酸睾酮的DMEM/F12培养液培养的同期传代的泪腺上皮细胞作对照。③实验评估:应用TUNEL法检测泪腺上皮细胞凋亡,采用免疫细胞化学法检测泪腺上皮细胞Bax和Bcl-2表达。结果:①丙酸睾酮对过氧化氢诱导的泪腺上皮细胞凋亡的影响:与单纯加入100μmol/LH2O2组比较,加入不同浓度丙酸睾酮组泪腺上皮细胞凋亡率均明显下降且丙酸睾酮的抗凋亡作用呈现一定范围内的剂量依赖性[(15.15±1.05)%,(13.94±0.73)%,(12.51±0.91)%,(10.63±0.78)%,(8.19±0.85)%,P<0.01]。②免疫细胞化学法检测Bcl-2和Bax蛋白表达:与单纯加100μmol/LH2O2组相比较,同时加入1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5mol/L丙酸睾酮各组均可使泪腺上皮细胞Bcl-2的表达明显增强和Bax的表达明显减弱,且与丙酸睾酮的剂量呈正相关(Bcl-2:0.92±0.10,1.01±0.08,1.12±0.06,1.24±0.12,1.37±0.11;Bax:2.28±0.09,2.17±0.11,2.06±0.07,1.91±0.13,1.77±0.10,P<0.01)。结论:丙酸睾酮抑制泪腺上皮细胞凋亡的机制可能与凋亡调节相关基因Bcl-2表达上调和Bax表达下调有关。     

应激状态下肠上皮细胞凋亡水平的变化及其机制

目的探讨在氧化应激状态下肠上皮细胞凋亡水平的变化以及凋亡异常发生的分子机制。方法使用过氧化氢(H2O2)处理培养的HT-29细胞模拟机体活性氧(ROS)损伤肠上皮细胞的体内状况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法进行细胞生存力的检测;采用流式细胞术进行细胞凋亡的检测;采用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测凋亡相关蛋白的表达。结果H2O2可降低HT-29细胞生存率,且呈现剂量依赖性和时间依赖性(P均<0.05);与空白对照组相比,随着H2O2浓度的增高,细胞凋亡率增加(P均<0.05),随着作用时间的延长,细胞凋亡率也增加(P<0.05);以不同浓度H2O2刺激HT-29细胞24h后发现,与空白对照组相比,Bax的表达随着H2O2浓度的增高而增加,Bcl-2的表达随着H2O2浓度的增高而降低。以500μmol/L,浓度的H2O2刺激HT-29细胞发现,Bax表达随着H2O2作用时间延长而增加,Bcl-2表达随着H2O2作用时间延长而降低。结论应激状态下,肠上皮细胞氧化应激水平与其凋亡程度相关,凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax比值失调可能是肠上皮细胞凋亡过度的机制之一。     

苦参碱对人肺癌SPC-A-1细胞Bcl-2、Fas表达的影响

目的了解苦参碱（matrine）作用人肺癌细胞株SPC-A-1后其相关凋亡基因Fas、Bcl-2的变化。方法不同浓度苦参碱作用于体外培养人肺癌细胞株SPC-A-1,流式细胞术检测其凋亡相关基因Bcl-2、Fas蛋白表达的改变。结果不同浓度的苦参碱处理人肺癌SPC-A-1细胞后,流式细胞仪检测随着苦参碱浓度的升高,Bcl-2的表达量减少、Fas的表达量增加且呈剂量效应（P〈0．05）。结论苦参碱诱导人肺癌细胞株SPC-A-1细胞凋亡,其机制可能与降低Bcl-2、升高Fas等活性有关。     

Bcl-2环状结构域对Bcl-2蛋白结构的影响

目的探讨Bcl-2 Loop domain环状结构域安全检查突变对Bcl-2蛋白结构的影响。方法在同济大学附属东方医院细胞治疗室分别对Bcl-2 Loop domain结构域的55和70位氨基酸行点突变及对Bcl-2 Loop domain结构域行缺失突变并应用PCR及Western blot方法检测Bcl-2 Loop domain结构域突变前后Bcl-2蛋白的表达变化。结果对Bcl-2 Loop domain结构域的55和70位氨基酸进行点突变组,Bcl-2蛋白在上清中和沉淀中均能检测到,对Bcl-2 Loop domain结构域行缺失突变组Bcl-2蛋白只在沉淀中表达,在上清中未检测到。结论Bcl-2 Loop domain结构域在Bcl-2蛋白结构中起到重要作用。     

食管癌的危险因素与Bcl-2 P^53的相关性研究

目的研究Bcl-2、P53与食管癌危险因素之间的相关关系,从分子水平对食管癌病因进行初步探讨.方法采用流行病学病例对照研究和免疫组化方法,研究分析食管癌危险因素Bcl-2、P53基因表达情况. 结果社会文化、生活水平较低,长期大量饮酒和营养缺乏是台州地区食管癌发生的主要危险因素并与Bcl-2、P53阳性表达存在明显相关性. 结论社会生活水平较低,长期大量饮酒、营养缺乏是台州地区食管癌主要的危险因素,Bcl-2、P53在食管癌发生中起重要作用.     

人参和氯沙坦对缺血-再灌注心肌细胞Bcl-2表达的研究

目的　探讨人参和氯沙坦对缺血 再灌注心肌细胞Bcl- 2基因表达的影响。方法　用原位杂交和免疫组化分别检测人参和氯沙坦治疗后的大鼠缺血 再灌注心肌细胞内Bcl- 2mRNA和蛋白质含量 ,并与对照组比较。结果　氯沙坦组与对照组心肌细胞内Bcl- 2mRNA、蛋白含量无明显差别 (P >0 0 5 ) ,人参组Bcl- 2mRNA含量增加 (P <0 0 5 ) ;Bcl- 2蛋白表达增多 (P <0 0 1)。结论　人参能明显增加缺血 -再灌注心肌细胞内Bcl- 2基因表达