人TIMP-2基因逆转录病毒重组体的构建及表达

目的：构建含人ＴＩＭＰ－２基因可调控逆转现毒重组体。方法：通过四步亚克隆将编码人组织金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）的基因片段从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中切下,定向插入经改良的逆转录病毒载体ｐＬ－ＭＴ上,以限制性内切酶鉴定插入方向是否正确。结果：结果：限制性内切酶谱分析与理论计算相等。结论：含人组织金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ－２基因可逆转录病毒重组体构建成功,为体外胶原代谢的基因调控研究提供     

抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建

目的构建抑制血管内皮生长因子（VEGF）活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅢ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组质粒经EcoRⅢ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致。结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

PIG-A基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的建立

目的 构建含磷脂酰肌醇聚糖A类基因(PIG-A)的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,Bam HⅠ及XhoⅠ双酶切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1,用限制性内切酶和DNA序列测定的方法对重组质粒进行鉴定.脂质体法转染PA317包装细胞,荧光显微镜下观察EGFP瞬时表达,G418筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果 酶切证实PIG-A基因克隆至逆转录病毒载体,测序结果和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,24～48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达.经G418筛选得到6个稳定抗性克隆,病毒滴度最高达1.6×105CFU/ml.结论 构建了含PIG-A基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶基因转移载体的构建

目的：构建逆转录病毒介导的诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转移载体。方法：应用ＤＮＡ重组和ＰＣＲ扩增技术。结果：通过二步克隆，从质粒ｐＫＳｉＮＯＳ分离编码巨噬细胞ｉＮＯＳ的生长ｃＤＮＡ，亚克隆于中间载体ｐＳＰ７２，调整插入片段二端酶切位点；进而构建含ｉＮＯＳ基因、巨细胞病毒启动子和ｎｅｏ抗生基因的逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸｉＮＯＳ。限制性酶切分析和ＰＣＲ鉴定证实，重组体ｉＮＯＳ插入片段的大小和方向     

人HOXA1 3'-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的:针对人同源异型盒A1(HOXA1)基因的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)构建HOXA1的荧光素酶报告基因载体,对其克隆进行鉴定并挑选出正确的克隆,为后续功能研究提供基础。方法:PCR扩增包含HOXA1 3'-UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建HOXA1 3'-UTR荧光素酶报告基因载体,经Not I和Xho I双酶切后测序进行鉴定。结果:克隆获得的DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论:成功构建了含hURAT1基因3'UTR区的荧光素酶报告载体,可用于后续功能研究。     

Construction of an inducible nitric-oxide synthase gene transferring vector mediated by retrovirus

目的：构建逆转录病毒介导的诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转移载体．方法：应用ＤＮＡ重组和ＰＣＲ扩增技术．结果：通过二步克隆，从质粒ｐＫＳｉＮＯＳ分离编码巨噬细胞ｉＮＯＳ的全长ｃＤＮＡ，亚克隆于中间载体ｐＳＰ７２，调整插入片段二端酶切位点；进而构建含ｉＮＯＳ基因、巨细胞病毒启动子和ｎｅｏ抗性基因的逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸｉＮＯＳ．限制性酶切分析和ＰＣＲ鉴定证实，重组体ｉＮＯＳ插入片段的大小和方向正确．结论：获得含ｉＮＯＳ基因逆转录病毒表达载体，为建立ｉＮＯＳ基因修饰的神经细胞模型，研究ＮＯ／ＮＯＳ在阿片耐受依赖中的作用奠定基础．     

乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达

目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。     

pRNAT-U6.1/Neo系统在E2F-3基因RNA干扰载体构建中的应用

目的:构建针对E2F-3基因的siRNA表达载体.方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F-3基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火、克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,重组构建RNAi质粒.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果.结果:重组构建的pRNAT-U6.1/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致,插入序列无点突变位点.结论:载体的成功构建为进一步研究E2F-3基因在膀胱肿瘤中的作用奠定了基础,为进一步以其为靶点进行膀胱癌细胞系体外实验创造了条件.     

小鼠睫状神经营养因子基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：分别构建野生型和截短型小鼠睫状神经营养因子（CNTF）基因的真核表达载体。方法：通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增小鼠CNTF野生型全长编码序列，体外定点突变获取截短型CNTF的互补DNA（cDNA）编码序列．将上述两序列分别克隆至pGEM—T Easy载体，经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后，将野生型和截短型CNTF基因连入pTracer—CMV真核表达载体，DNA测序鉴定。结果：PCR成功扩增了野生型和截短型CNTF基因，DNA序列分析证实两种真核表达载体中的CNTF序列与GeneBank中目的序列一致。结论：野生型和截短型CNTF基因真核表达载体的成功构建为视网膜色素变性（RP）的基因治疗研究奠定了基础。     

湖北株HPV16E7基因疫苗的构建及免疫性研究

用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切PWR590－1,所得湖北株HPV16E7片段克隆入真核表达载体pcd3.1^-,构建了湖北株HPV16E7基因疫苗,皮下注射BALB／c近交系小鼠,体外应用酶联免疫吸附实验（Elisa)法和MTT法分别检测了湖北株HPV16E7基因疫苗在体内产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

G156A MGMT体外定点诱导突变及逆转录病毒载体的构建

目的：获得含突变位点G156A（第156位点的甘氨酸突变为丙氨酸）的六氧甲基鸟嘌呤－DNA－甲基转移酶（O^6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)，并构建含G156A MGMT（△MGMT)的逆转录病毒载体。方法：通过体外定点诱导突变技术产生G156A突变的MGMT，将其克隆入pGEM-T载体，进一步亚克隆至G1Na逆转录病毒载体。结果：通过DNA测序分析证实预期位点GGC（甘氨酸）突变为GCC（丙氨酸），经PCR及酶切分析证实成功构建了逆转录病毒载体G1Na-△MGMT。结论：通过体外定点诱导突变技术成功获得了G156A MGMT，并运用基因重组技术构建了逆转录病毒表达载体G1Na-△MGMT，为进一步将G156A MGMT转导造血干细胞对化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

Livin shRNA慢病毒载体的成功构建及鉴定

目的构建携带livin基因短片段发卡RNA（livin shRNA）的慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的干扰人livin基因的有效靶序列,设计、合成靶序列的寡聚脱氧核苷酸DNA序列（OligoDNA）,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的携带U6启动子和绿色荧光蛋白的pGCL—GFP载体连接产生短片段发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果PCR鉴定与DNA测序证实合成的含livin shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论成功构建人livin shRNA慢病毒载体。     

hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆及序列分析

目的：构建含限制性内切酶位点PstⅠ、KpnⅠ的hMSH2基因cDNA保守区域的pGEM-T-S载体,比较分析序列的变化,为以后的毒理学研究提供实验材料,方法：从人胚肺成纤维细胞HLF中抽提总RNA进行RT－PCR扩增,直接与T载体连接转化大肠杆蓖DH5α,用蓝／白斑试验筛选阳性克隆,抽提质粒进行酶切鉴定,再行序列分析。结果：经RT－PCR获得631bp含量制性内切酶位点的阳性产物,T载体克隆、酶切鉴定及序列分析后证实,克隆片段与genbank中该基因的序列同源性为99．5％。结论本文成功地构建了含hMSH2基因cDNA保守区域的T载体克隆,该克隆可为DNA错配修复缺陷与致癌关系研究提供工具。     

异种移植模型转人a1,2岩藻糖基转移酶基因小鼠显微注射DNA片段的制备

目的制备转人琢1,2岩藻糖基转移酶(HT)基因小鼠显微注射DNA片段。方法引物两端设计酶切识别位点,聚合酶链反应(PCR)扩增HTcDNA全长序列,两端含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切识序列;回收HTcDNA片段并与PMD18-T载体连接,EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切纯化质粒鉴定;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pMD18-HTcDNA重组质粒和pCMV-MCS质粒,回收HTcDNA片段和pCMV-MCS质粒片段,进而连接,转化感受态细菌,纯化质粒对其进行酶切、PCR和测序鉴定;PvuⅠ和NotⅠ依次单酶切重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,回收大小约2.85kb片段,溶于适量显微注射用缓冲液。结果成功构建了重组质粒pCMV-MCS-HTcDNA,酶切回收了2.85kb的显微注射DNA片段。结论通过基因工程技术可以获得转人HT基因小鼠显微注射DNA片段,包含基因表达元件,可以用于显微注射法建立转人HT基因小鼠。     

人Bcl—2基因短发夹样RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人Bcl-2基因序列特异性的短发夹样RNA（Short Hairpin RNA，shRNA）质粒载体。方法根据Bcl-2基因序列及shRNA设计原则，化学合成4段编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGPH1／GFP／Neo中H1启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立阴性对照，并对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。结果限制性内切酶PstⅠ和BamH Ⅰ酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGPH1／GFP／Neo质粒中，测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。结论针对人Bcl-2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究Bcl-2功能奠定了良好的基础。     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

湖北株HPV_(16)E_7基因疫苗的构建及免疫性研究

用 Eco R 和 Hind 双酶切 PWR5 90 -1,所得湖北株 HPV1 6 E7片段克隆入真核表达载体 pcd3.1- ,构建了湖北株HPV1 6 E7基因疫苗 ,皮下注射 BALB/c近交系小鼠 ,体外应用酶联免疫吸附实验 ( Elisa)法和 MTT法分别检测了湖北株 HPV1 6 E7基因疫苗在体内产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力。     

小鼠CD1d2编码区基因的克隆与鉴定

目的:克隆小鼠CD1d2编码区基因。方法:提取小鼠胸腺组织总RNA,用RT-PCR技术扩增CD1d2cDNA,PCR产物连接pGEM-T载体,转化大肠杆菌,用限制性酶切反应和DNA测序对阳性克隆进行鉴定,用BLAST软件进行序列分析。结果:扩增出一条特异DNA条带,DNA序列测定表明获取了大小为1008bp的小鼠CD1d2基因编码区基因。结论:成功克隆了小鼠CD1d2编码区基因。