人真皮原代成纤维细胞的培养、鉴定及蛋白酶活性受体的表达

目的探索和建立人真皮原代成纤维细胞培养并鉴定纯度,检测蛋白酶活性受体在该细胞的表达状态。方法用胰酶消化法分离人包皮成纤维细胞并培养人真皮原代成纤维细胞,用免疫细胞化学法鉴定纯度;用RT-PCR、流式细胞分析和免疫细胞化学染色法检测蛋白酶活性受体的表达。结果胰酶消化法成功培养出人真皮原代成纤维细胞,纯度达99%;人真皮成纤维细胞高表达PAR1、PAR3 mRNA及蛋白,微弱表达PAR2 mRNA及蛋白,不表达PAR4 mRNA及蛋白。结论用胰酶消化法成功培养高纯度原代人真皮成纤维细胞;蛋白酶活性受体1、3在人真皮成纤维细胞上高表达,提示可能存在于炎症及损伤修复功能作用,为进一步研究打下基础。     

CIA大鼠滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠滑膜成纤维细胞的培养方法并观察细胞生物学特点。方法收集CIA和正常大鼠的膝关节滑膜组织,采用组织块贴壁法培养滑膜成纤维细胞,观察细胞游出、生长情况;HE染色观察细胞形态;免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度;Masson染色观察细胞分泌胶原蛋白情况;CCK-8法检测细胞增殖情况。结果倒置显微镜及HE染色观察细胞形态及生长特征符合滑膜成纤维细胞,且98%以上的细胞表达Vimentin蛋白。模型组滑膜成纤维细胞较正常组细胞游出时间早且细胞量多;模型组细胞分泌胶原蛋白能力及细胞增殖能力较正常组强。结论本研究确立了CIA大鼠滑膜成纤维细胞原代培养体系,并且证实CIA大鼠滑膜成纤维细胞增殖与分泌功能较正常滑膜成纤维细胞强。     

乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。方法：选取新出生1 d的新西兰白兔，采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化心脏组织，差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞；使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，绘制细胞生长曲线；采用CCK-8法检测细胞活力；波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度；Western blot法检测异丙肾上腺素刺激心脏成纤维细胞后Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）水平。结果：差速贴壁90 min后在相差显微镜下可见部分成纤维细胞已贴壁生长；3 d后成纤维细胞数量较前增多，形态多样，多为不规则的多边形及扁平形；5 d时成纤维细胞数量显著增多（P<0.05），细胞形态趋于多样性，细胞间完全融合；细胞生长曲线类似“S”形。波形蛋白阳性率可达95%。CCK-8实验结果显示在4～5 d细胞活力最强（P<0.05）；给予第2代心脏成纤维细胞异丙肾上腺素刺激48 h后，Col I及α-SMA水平显著增加（P<0.05）。结论：本研究建立了乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。     

小鼠乳鼠心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的探索更高效、稳定的小鼠乳鼠心脏成纤维细胞原代培养的方法。方法采用Ⅱ型胶原蛋白酶多次消化法,通过控制乳鼠日龄、胶原蛋白酶含量以及消化时间这三个条件,对小鼠乳鼠心脏成纤维细胞的提取进行优化。使用显微观察心脏成纤维细胞的形态,CCK-8法检测细胞活性,免疫荧光细胞化学染色检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达鉴定细胞纯度。结果 1 d日龄、 1 g/L胶原蛋白酶、每次消化2 min,所得细胞活力最佳,增殖能力最强,且此条件下提取的小鼠乳鼠原代心脏成纤维细胞纯度高于95%。结论建立了高效、稳定的小鼠乳鼠原代心脏成纤维细胞培养方法。     

人胃癌肿瘤相关成纤维细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨人胃癌肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)的培养和鉴定方法,并分析其与胃正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)在生物学特性和蛋白表达方面的差异,为其功能研究奠定基础.方法 采用组织块法和酶消化法进行人胃癌CAFs和NFs的原代培养,通过酶消化法进行人工纯化,通过形态学观察和多种蛋白的免疫细胞化学染色对其进行鉴定.结果 获得纯化的人胃癌CAFs和NFs.胃癌CAFs呈长梭形,大小不等,生长密集,排列紊乱.除表达vimentin这一成纤维细胞的标记物外,还表达FAP、SMA,但不表达CK、desmin.结论 只要给细胞创造良好的生长条件并规范操作,组织块法和消化法均可成功的培养出人胃癌CAFs和人胃NFs.胃癌CAFs与NFs在形态结构、生长方式和蛋白表达等方面均存在明显差异.     

成年小鼠肺成纤维细胞分离纯化及原代培养

成年小鼠肺成纤维细胞的原代培养是获得肺组织后在体外进行的培养,最能反映体内的生长特性,对研究细胞的生长分化及其生理病理变化的机制具有极其重要的价值,具有细胞系所无法比拟的优点.本文主要探讨合理的成年小鼠肺成纤维细胞的分离纯化培养方法及其生长曲线特点. 1材料与方法 1.1试剂:高糖DMEM(Gibco公司),胎牛血清(杭州天杭公司),胰蛋白酶(Sigma公司),波形蛋白vimentin、α-平滑肌肌动蛋白α-SMA抗体和免疫组化SABC试剂盒(武汉博士德公司). 1.2实验动物:清洁级雄性成年昆明小鼠(25±5)g[华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2008-0005].     

小鼠血管外膜成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 建立小鼠胸主动脉外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts,AF）组织块贴壁法培养模型.方法 组织块贴壁法培养小鼠AF,并在光镜下观察细胞形态,免疫细胞荧光染色法鉴定细胞类型,绘制细胞生长曲线.结果 AF能够迅速从组织块长出并增殖,光镜下细胞呈梭形或多边形,免疫荧光染色结果显示细胞质中有波形蛋白相关抗原存在,CD31和α-平滑肌肌动蛋白染色为阴性,细胞在第2～7天进入指数生长期.结论 组织块贴壁法适用于小鼠AF的原代培养,为研究AF生物学功能提供了充足、可靠的靶细胞模型.     

成年小鼠心成纤维细胞的原代培养及生物学特性

目的:建立适用于成年小鼠心成纤维细胞的体外分离培养及鉴定的技术方法.方法:应用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶联合消化法及组织贴块法两种方法对小鼠心成纤维细胞进行体外培养.在倒置显微镜下观察心成纤维细胞生长情况;台盼蓝法测定细胞传代成活率;通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种方法获得的心成纤维细胞的增殖情况;观察不同培养基对心成纤维细胞生长的影响;苏木素-伊红(HE)染色观察细胞形态,采用免疫荧光染色观察培养细胞波形蛋白、纤维连结蛋白及盘状结构域受体2(DDR2)的表达.结果:酶联合消化法分离培养的细胞1d后,在倒置相差显微镜下可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3d后生长迅速呈长梭形;贴块法培养的细胞4d后,可见细胞从组织块边缘长出,7d后细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为97％.两种方法获得的第3代细胞生长曲线近似“S”形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显;酶联合消化法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为62.61％和30.87％,组织贴块法培养的细胞G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为69.24％和28.05％;含100 mL/L胎牛血清的HG/DMEM培养基培养的细胞出现明显对数期.两种方法培养的第3代细胞行苏木素-伊红染色可见细胞漩涡状排列,免疫荧光检测波形蛋白、纤维连接蛋白及盘状结构域受体2表达阳性.结论:两种方法均可高效获得心成纤维细胞在体外稳定培养.与贴块法培养相比较,利用联合酶消化法能较有效的获得波形蛋白、纤维连结蛋白、DDR2高表达阳性的心成纤维细胞.     

人牙龈成纤维细胞原代培养及冻存和复苏

背景：牙龈成纤维细胞是牙龈固有结缔组织层中主要的细胞,在许多生理和病理过程中起着重要作用。 目的：对人牙龈成纤维细胞进行原代培养、鉴定、冻存及复苏。 方法：采用组织块培养法培养人牙龈成纤维细胞,并进行形态学和免疫学鉴定。对人牙龈成纤维细胞进行冻存与复苏,倒置显微镜下观察细胞形态变化。 结果与结论：人牙龈成纤维细胞原代培养成功率为86.7%,细胞呈梭形或纺锤形。免疫组织化学鉴定抗波性蛋白抗体染色阳性,抗角蛋白抗体染色阴性,为中胚层来源的成纤维细胞。牙龈成纤维细胞冻存与复苏成功,细胞经2次传代后生物学性状与原代相似。提示采用组织块培养法培养原代人牙龈成纤维细胞及冻存与复苏方法可行。     

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养及饲养层制备

目的建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层,用于胚胎干细胞的培养。方法取孕13～15d的昆明种小鼠,分离原代成纤维细胞,在37℃时,用0.25%胰蛋白酶(含0.04%EDTA)消化组织块5min,重复消化多次,24h首次换液,培养3d后传代。采用10μg/mL丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞3h,制备出的饲养层细胞能有效地抑制胚胎干细胞的分裂,且不影响其活力。结果胎鼠分离原代成纤维细胞经10μg/mL丝裂霉素C处理后,细胞仍保持分泌多种生长因子的能力,在10d内既不增殖,也不死亡,能够很好的维持胚胎干细胞克隆的生长。结论该方法制备的饲养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

人皮肤成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的：建立人皮肤成纤维细胞的体外原代及传代培养并鉴定的技术方法.方法：取临床无菌切除的幼儿包皮,利用胶原酶分离表皮和真皮,将真皮剪成肉糜状,再用胰蛋白酶消化,接种于培养皿,加少许含10％小牛血清的DMEM-高糖培养液进行培养,次日补加培养液.原代长满后,进行传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及组化鉴定.结果：接种次日倒置镜下可见有长梭形细胞迁出、生长,5-6d进行传代,传代后约5d长满,可长期传代.免疫组化Vimentin表达阳性.结论：该方法可快速高效获得构建组织皮肤真皮所需的成纤维细胞.     

人GDNF在原代培养的大鼠成纤维细胞中的表达

目的：研究人脑胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在治疗神经系统疾病中的作用，克隆其前体蛋白cDNA序列，并用于真核细胞表达，方法：提取我国自建的脑胶质瘤BT325细胞总RNA，用逆转录PCR法扩增GDNF全长cDNA并构建其真核表达载体pCI-neo-GDNF，然后转染原代培养的成纤维细胞，免疫组织化学及原位杂交检测GDNF在细胞中的表达。结果：从国人脑胶质瘤细胞中扩增到558bp的GDNF全长cDNA，并在GDNF转基因原代成纤维细胞中检测到重组GDNF的转录和表达。结论：克隆到的GDNF全长cDNA片段，可用于真核细胞表达，其转基因细胞脑内移植后应能治疗包括帕金森病的内的神经系统变性疾病。     

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景：增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。 目的：建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。 方法：采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。 结果与结论：组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40 d可传第1代,以后每7-10 d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20 d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。     

成人骨骼肌细胞原代培养

本研究以获取基因治疗自体移植的载体为目的 ,观察了生长因子对成人骨骼肌卫星细胞增殖的影响。用手术中取得的成人骨骼肌进行体外组织块培养及酶消化培养 ,用成纤维细胞生长因子及表皮生长因子进行处理 ,作动态观察。结果证明 ,消化分离出的肌卫星细胞数量极少 ,培养不能成活 ;组织块培养肌卫星细胞的增殖与生长因子的作用有关 ,成纤维细胞生长因子及表皮生长因子处理组的增殖细胞数显著高于对照组。提示 ,生长因子可促进成年人骨骼肌卫星细胞增殖 ,但与其年龄及部位有一定关系。     

大鼠原代肝细胞的培养及鉴定

目的:探讨体外大鼠肝细胞的分离培养及纯化的方法。方法:采用胶原酶Ⅳ消化组织块法分离新生大鼠肝细胞,对大鼠肝细胞进行纯化、培养,并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定。结果:培养24 h,有部分细胞贴壁,48 h有大量细胞贴壁,但含有较多杂细胞。经过4~5次传代后,细胞形态一致,可见许多双核细胞和多核细胞。采用抗大鼠细胞角蛋白(ck-18)的特异抗体进行免疫细胞化学鉴定,经SP染色DAB显色后,阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒,阴性对照未见着色。结论:成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定,为进一步的实验研究奠定了基础。     

原代癌相关成纤维细胞和正常成纤维细胞特征比较及对结直肠癌细胞EMT影响

目的：观察原代癌相关成纤维细胞（ cancer associated fibroblasts, CAFs）和正常成纤维细胞（ normal fibroblasts, NFs）特征及其对结直肠癌细胞SW620上皮间质转化（ epithelial?mesenchymal transition, EMT）的影响。方法鉴定 NFs和 CAFs,比较两者活化和衰老程度。通过间接共培养实验观察两者对SW620细胞EMT和迁移能力影响。结果 NFs 和 CAFs 表达纤连蛋白（ Fibronectin ）和α?平滑肌动蛋白（α?smooth muscle actin,α?SMA）,不表达 E?钙黏蛋白（E?Cadherin）。 CAFsα?SMA 表达和衰老程度高于NFs。 CAFs促进SW620细胞E?Cadherin下调、波形蛋白（ vimentin）和Fibronectin上调, Wnt信号蛋白磷酸化的β?连环蛋白（Ser552, S552）和蓬乱蛋白（Dishevelled 3, DVL3）上调,促进其迁移。 NFs对SW620细胞EMT和迁移能力无影响。结论 CAFs活化和衰老程度大于NFs; CAFs促进结直肠癌细胞EMT、迁移和Wnt信号上调; NFs对结直肠癌细胞EMT和迁移能力无影响。     

人良性胆管瘢痕成纤维细胞的培养和鉴定

成纤维细胞(fibroblast,Fb)过度增生是良性胆管瘢痕狭窄形成的主要原因[1];前期研究发现Fb在良性胆管瘢痕病变中可向肌成纤维细胞转化,并能表达凋亡相关因子如Sur-vivin、BCL-2、BAX等,以及血管生成相关因子如VEGF等[2];而正常组织的成纤维细胞未见表达。另有研究报道不同组织来源的Fb生物学行为有所不同[3],分离培养人良性胆管瘢痕来源的Fb将对该病变的研究提供有利条件。本研究通过组织块培养法体外培养人良性胆管瘢痕Fb,并鉴定证明     

优选人脱细胞真皮基质及荧光标记示踪与其复合培养的成纤维细胞

目的 优选人脱细胞真皮基质(ADM)并评价其生物学特性. 方法 通过高渗盐-NaOH消蚀法(A组)、高渗盐-十二烷基硫酸钠(SDS)法(B组)和DispaseⅡ-Triton X-100法(C组)制作人脱细胞真皮基质,以特殊染色、免疫组织化学观察3种方法 制作ADM的组成成分;四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验评价3种方法 制作ADM的细胞毒性反应;细胞培养法评价其细胞相容性,优选ADM .重组腺病毒绿色荧光表达载体(Ad-GFP)转染的人成纤维细胞(FB)接种在优选ADM上,荧光显微镜观察 FB的生长情况. 结果 3种方法 均能够保留胶原纤维、弹性纤维, A组和C组能够完全脱去细胞,B组未能完全脱去细胞;A组和B组制备ADM细胞毒性反应小于1级;C组制备ADM细胞毒性反应大于1级.A组与B组24h 3T3细胞贴壁数有统计学意义( P <0.05),3T3细胞能够在A组ADM表面贴附;优选A组ADM.转染Ad-GFP的FB在优选ADM上生长和增殖良好. 结论 高渗盐-NaOH消蚀法制备的ADM蕴涵丰富的生物信息,细胞毒性小,生物相容性好,是一种很好的生物支架材料.     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)原代培养、传代及鉴定的方法.方法 采用肾小管节段贴块培养法与3种消化培养法(胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA、胶原酶Ⅰ)进行小鼠肾小管上皮细胞原代培养,锥虫蓝染色后镜下观察消化后细胞成活率、细胞形态和数量.胰蛋白酶消化传代,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类.结果 贴块法和胶原酶Ⅰ消化培养法均能成功培养小鼠肾小管上皮细胞,两者相比,胶原酶Ⅰ消化培养法培养的细胞生长更快.结论 胶原酶Ⅰ消化培养法是小鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法.