气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬功能的影响及HIF-1α的作用

目的:探讨气道上皮细胞对巨噬细胞表型和吞噬活性的影响及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的作用。方法:将不同浓度(0、100、200、400和800μmol/L)氯化钴(CoCl_2)处理或转染HIF-1αsi RNA的人支气管上皮(HBE)细胞与12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系THP-1分化的巨噬细胞共培养,RT-qPCR检测HBE细胞HIF-1α的m RNA表达,流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物的表达及对大肠杆菌的吞噬率。结果:CoCl_2浓度依赖性增加HBE细胞HIF-1α的m RNA表达,8 h为峰值,同时CoCl_2处理的HBE细胞也增加共培养的巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18荧光强度比率,800μmol/L处理的HBE细胞作用最强;共培养8 h和12 h的巨噬细胞CCL3荧光强度比率增加最明显,而共培养24 h的巨噬细胞CD163、CD206和CCL18荧光强度比率上升更明显。转染HIF-1α-Homo-488 si RNA的HBE细胞对巨噬细胞CCL3、CD163、CD206和CCL18的刺激作用明显减弱。与不同浓度CoCl_2处理的HBE细胞共培养24 h的巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬率最初(60 min以前)均呈不同的上升趋势,其后吞噬率均降低。相对于正常HBE细胞共培养组,400和800μmol/L刺激组在各时点的吞噬率均降低,其中800μmol/L刺激组降低最明显。结论:低氧环境下气道上皮细胞早期增强巨噬细胞向M1优势转化,而长期低氧作用的气道上皮细胞抑制巨噬细胞吞噬作用并向M2优势转化,HIF-1α可能是这些过程的重要介质。     

Ficolin 3的表达、纯化及其对RAW264.7巨噬细胞的活化作用

目的构建人ficolin-3基因的原核表达载体在大肠杆菌中表达后纯化,检测可溶性His-ficolin在诱导巨噬细胞系RAW264.7活化中的作用。方法从人外周血单个核细胞cDNA中扩增人ficolin-3基因的cDNA序列,将其插入pET22原核表达载体中,酶切鉴定并测序验证重组质粒pET22b-ficolin 3后,在大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化His-ficolin 3。以His蛋白为对照,利用流式细胞术检测不同浓度可溶性His-ficolin 3对RAW264.7细胞吞噬鸡红细胞能力的影响,利用ELISA检测His-ficolin 3对RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α的影响。结果酶切鉴定获得预期目的片段,测序证实重组质粒pET22b-ficolin 3构建成功。SDS-PAGE提示相对分子质量(Mr)33 000处有可溶性目的蛋白His-ficolin 3表达,His柱纯化后产物纯度在90%以上。Western blot法检测证实纯化产物为His-ficolin 3。和His蛋白相比,His-ficolin 3对RAW264.7细胞的吞噬能力具有剂量依赖性,即His-ficolin3浓度越高,吞噬能力越强;此外,His-ficolin3能显著诱导RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α等炎性细胞因子。结论成功构建了pETb-Ficolin 3重组载体并获得了纯度为90%以上的His-ficolin 3。His-ficolin 3能够显著促进巨噬细胞RAW264.7的活化。     

小鼠MIP-1α-DT390重组免疫毒素原核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠MIP-1α基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的原核融合表达载体,诱导并鉴定该蛋白的表达.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,通过PCR扩增质粒SPα-DT390获得DT390基因,酶切、连接,构建原核表达载体pET-32a( )-mMIP1-1α-DT390,重组质粒证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导融合蛋白表达,并用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法鉴定.结果 成功构建了mMIP-lα与DT390基因的原核融合表达载体pET-32a( )-mMIP-Iα-DT390,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达蛋白的相对分子质量与预期值一致,并可被抗mMIP-1α和抗白喉毒素的特异性抗体所识别.结论 获得了mM皿1α与DT390融合基因在原核系统中的稳定表达,为研究其临床应用奠定了基础.     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:对鼠白细胞介素15受体α亚单位(IL-15Rα)的胞外区段,即可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)进行原核表达及纯化,并测定其配体结合能力及相应生物学功能.方法:采用RT-PCR方法,以鼠脾脏细胞总RNA为模板扩增编码sIL-15Rα的基因片段,经测序确证后与原核表达载体pQE-30连接,所得重组表达质粒pQE-30 /sIL-15Rα转化E.coli M15构建表达重组子.通过降低诱导温度和IPTG浓度的方式实现重组蛋白的可溶性表达,金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot验证.采用固相受体结合分析法测定重组蛋白与IL-15间的亲和力,并以CTLL-2细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果:成功构建了重组表达质粒pQE-30 /sIL-15Rα,并在25℃、0.5 mmol/L IPTG条件下实现了重组蛋白的可溶性表达.所得重组蛋白的相对分子量约为29 kD,纯度大于95%,与IL-15之间的亲和力为4.9×10-11 mol/L,具有显著的协同IL-15促CTLL-2细胞增殖效应.结论:获得了功能性的重组蛋白sIL-15Rα,为深入系统地研究IL-15Rα的独特生物学性状,以及开展IL-15靶向性的研究工作奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16．3蛋白的原核表达及功能检测北大核心CSCD

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析

目的对猫突触核蛋白(α-synuclein)进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21(DE3),获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41~54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。     

小鼠sIL-13Rα2在毕赤酵母菌中的表达及初步活性分析

目的:克隆并在毕赤酵母中表达小鼠sIL-13Rα2基因.方法:从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,应用分段PCR的方法将sIL-13Rα2基因定向克隆至酵母表达质粒pPICZα-A,并转染至毕赤酵母菌表达系统进行目的蛋白表达.目的蛋白行SDS-PAGE和Western分析.结果:克隆出可溶性IL-13Rα2目的基因片段,构建重组pPICZα-A/sIL-13 Rα2表达载体,成功转染至毕氏酵母菌,诱导表达出可溶性IL-13Rα2目的蛋白.结论:已成功克隆并在毕赤酵母中表达了小鼠可溶性IL-13Rα2目的基因,为应用sIL-13Rα2蛋白治疗哮喘及其他过敏性疾病奠定了基础.     

miR-101-3p通过靶向抑制斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)促进巨噬细胞对人肝癌细胞的吞噬作用

目的 探究miR-101-3p能否促进THP-1巨噬细胞对HCCLM3人肝癌细胞的吞噬作用及其机制。方法 通过慢病毒包装、感染和抗性筛选，获得绿色荧光蛋白(GFP)标记并过表达miR-101-3p的HCCLM3人肝癌细胞稳转系(HCCLM3^GFP-miR-101-3p),同时使用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞贴壁分化为M0型巨噬细胞。将两者共培养24 h后收集细胞，运用荧光激活细胞分选法(FACS)检测巨噬细胞吞噬效率。实时定量PCR检测斯坦尼钙调节蛋白1(STC1)、钙网蛋白(CRT)的mRNA表达水平，免疫荧光染色法检测CRT的表达和分布，Western blot法检测STC1、 CRT的蛋白表达水平，双荧光素酶报告基因实验分析miR-101-3p与靶基因的靶向调控关系。结果 过表达miR-101-3p促进THP-1巨噬细胞对HCCLM3肝癌细胞的吞噬作用，miR-101-3p通过靶向STC1进而上调HCCLM3细胞膜表面CRT的表达。结论 miR-101-3p通过靶向抑制STC1进而促进HCCLM3细胞膜表面CRT的表达，增强巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬作用...     

重组融合蛋白GX1-rmhTNFα的克隆、表达及鉴定

目的构建胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子(GX1-rmhTNF)基因的原核表达载体,表达GX1-rmhTNF蛋白。方法利用基因工程方法将胃癌血管特异性结合肽融合在新型人肿瘤坏死因子α的氨基末端,构建GX1-rmhTNF原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析。结果成功构建了GX1-rmhTNF重组融合表达质粒,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量(Mr)约18000处出现了1条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TNFα单克隆抗体特异性的结合能力。结论成功构建了GX1-rmhT-NF基因的原核表达载体并在原核细胞中表达了该产物,为下一步GX1-rmhTNF的纯化奠定了基础。     

原核表达及一步法制备可溶性白喉毒素突变体CRM197

目的构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化。方法将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体p ET-32a(+)载体上,Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒p GArasd,共同转化大肠杆菌Origami B(DE3),15℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白。结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品。与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性。结论通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定北大核心CSCD

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。     

哮喘小鼠支气管MIP-1α、RANTES基因和蛋白的表达

目的 :研究巨噬细胞炎性蛋白 - 1α(MIP - 1α)、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子 (RANTES)基因和蛋白在哮喘小鼠支气管中的表达情况。方法 :2 0只二级雄性BALB/C小鼠随机分为两组 :正常小鼠组 (A0 组 )和哮喘小鼠组 (B0 组 )。以卵清白蛋白 (OVA)致敏激发法复制小鼠哮喘模型 ,采用免疫组化法和原位杂交法测定两组小鼠支气管MIP - 1α、RANTES蛋白及基因的表达情况。结果 :免疫组化显示 ,B0 组支气管MIP - 1α、RANTES蛋白的表达均显著高于A0 组 (P <0 0 1) ,其主要表达细胞是上皮细胞 ;原位杂交亦显示 ,B0 组支气管MIP - 1α、RANTES基因的表达均显著高于A0 组 (P <0 0 1) ,其主要表达细胞是上皮细胞。结论 :本研究证明MIP - 1α和RANTES等在实验性哮喘时支气管中的高表达 ,上皮细胞是主要表达细胞。     

小鼠B细胞趋化因子原核表达与纯化

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。双酶切和测序分析显示小鼠 B细胞趋化因子片断正确插入原核表达载体 PQE30中 ,重组蛋白 Western blot分析显示出特异性条带。提示已通过基因工程方法获得并纯化了小鼠B细胞趋化因子重组蛋白。     

鸡C/EBP-α基因表达载体的构建及抗血清制备

目的:构建鸡C/EBP-α基因原核和真核表达载体及制备高效价的抗血清,为在蛋白质水平研究鸡C/EBP-α基因的功能以及与其他脂肪细胞分化调控基因间的时空协同关系奠定基础。方法:采用RT-PCR的方法,根据已知鸡的C/EBP-α基因cDNA序列,获取鸡C/EBP-α基因的cDNA片段,测序正确后分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3中。重组质粒pGEX-4T-1/C/EBP-α转化大肠杆菌BL21(DE3),不同浓度的IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测蛋白表达情况;真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α应用水压转染法,经RT-PCR检测外源C/EBP-α基因在小鼠肝脏中的表达情况,然后采用"DNAprime-protein boost"策略免疫小鼠,制备高效价的抗血清,应用Western blot检测抗血清的特异性。结果:构建了鸡C/EBP-α基因的原核和真核表达载体;SDS-PAGE显示C/EBP-α得到了特异性的表达;RT-PCR结果提示C/EBP-α mRNA在小鼠肝脏中表达;ELISA和Western blot结果表明基因免疫小鼠产生了高效价和特异性强的抗血清。结论:成功构建了鸡C/EBP-α基因的原核pGEX-4T-1/C/EBP-α和真核表达载体pcDNA3/C/EBP-α,外源基因C/EBP-α mRNA能在小鼠肝脏中有效表达,同时制备了高效价、特异性强的抗血清。