小鼠抗内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)多克隆抗体的制备

目的 以纯化的内质网相关的干扰素诱导病毒抑制蛋白(viperin)免疫小鼠制备其多克隆抗体并鉴定其特异性。方法对BALB/c小鼠颅内注射鸭坦布苏病毒,刺激小鼠脑组织产生viperin,通过反转录PCR从小鼠大脑组织克隆viperin,并将其插入至pGEX-6P-1原核表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta。用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组蛋白诱导表达,对其进行可溶性分析,以氯化钾染色切胶法对大量表达蛋白进行纯化;将纯化的重组viperin蛋白经腹部皮下免疫小鼠制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定多抗效价,Western blot法和间接免疫荧光法(IFA)检测BHK-21仓鼠肾成纤维细胞瞬时表达的viperin蛋白鉴定viperin抗体的特异性和敏感性。结果 成功克隆并表达小鼠viperin基因,制备的抗体效价可达1∶25 600,小鼠抗viperin多克隆抗体可特异性识别BHK-21细胞表达的viperin蛋白。结论 成功制备特异性较好的小鼠抗viperin多克隆抗体。     

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备与鉴定

目的:克隆小鼠TIM-3基因,构建原核表达载体,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法:以小鼠脾细胞总RNA为模板,用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3基因编码区,构建pRSET-B-TIM-3原核表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;然后常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,用Western blot、免疫组化、流式细胞术检测抗体的特异性。结果:成功构建的原核表达载体pRSET-B-TIM-3在大肠杆菌中诱导后可以高效表达TIM-3蛋白;免疫获得的多克隆抗体经过ELISA检测,抗体效价为1∶320 000,经Western blot、免疫组化和流式细胞术等鉴定,抗体的特异性较好。结论:成功克隆出小鼠的TIM-3基因,构建了原核表达载体,制备的兔抗小鼠TIM-3多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备兔抗小鼠白细胞介素23p19(IL-23p19)多克隆抗体。方法利用分子克隆技术构建重组表达质粒p ET-16b-IL-23p19,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定蛋白,镍柱亲和层析纯化制备蛋白;以此蛋白为免疫抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清,并利用亲和层析法纯化抗血清,制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体;采用ELISA检测抗体效价;Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达载体p ET-16b-IL-23p19构建正确且IL-23p19蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中有效表达。通过多次IL-23p19蛋白免疫新西兰大白兔,成功制备兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体。ELISA检测确定新西兰大白兔血清效价达1∶256 000,Western blot法证实兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体能特异性识别小鼠IL-23p19蛋白。结论成功制备了兔抗小鼠IL-23p19多克隆抗体,抗体具有高的效价和较好的特异性。     

鸡肺表面活性蛋白A的表达及其多克隆抗体的制备

目的表达鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)重组蛋白,并制备鼠抗cSP-A多克隆抗体。方法人工合成cSP-A的凝集素糖识别区(CRD)基因(cSP-A-CRD),亚克隆到pGEX-6P-1载体中进行原核表达,对表达产物进行鉴定。切胶纯化法纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备抗cSP-A多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法、免疫荧光组织化学染色和ELISA鉴定该抗体的特异性和适用范围。结果获得鼠抗cSP-A血清,效价达到105;Western blot法结果表明多抗血清具有良好的特异性和反应性,并可用免疫荧光组织化学技术检测鸡肺上皮细胞表达的cSP-A和用间接ELISA检测鸡肺灌洗液中存在的水溶性cSP-A蛋白。结论成功表达了cSP-A重组蛋白并制备了小鼠抗cSP-A多克隆抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定北大核心CSCD

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

人IL-37在大肠杆菌表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达白细胞介素37(IL-37)及制备其多克隆抗体。方法 PCR扩增IL-37b成熟肽编码区基因,克隆至表达载体pET28a,转化大肠杆菌感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白IL-37为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗体,用ELISA、Western blot法和免疫组织化学染色检测抗体的效价和特异性。结果原核表达了重组蛋白IL-37b成熟肽,并获得高效价的小鼠抗IL-37抗体,能特异性识别天然的IL-37抗原。结论成功制备效价高、特异性好的小鼠抗IL-37抗体。     

疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体制备及鉴定

目的制备抗疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体,鉴定其与组织抗原MDIi的反应性。方法以PCR扩增获得MDIi序列构建原核表达载体pET-32a/MDIi,转化大肠杆菌进行表达;对表达产物鉴定后,免疫小鼠制备抗MDIi多克隆抗体;间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体与疣鼻栖鸭组织MDIi的反应强度。结果成功构建了pET-32a/MDIi原核表达载体,诱导表达了相对分子质量(Mr)约40 000的包涵体形式的MDIi重组蛋白,免疫小鼠获得效价为1∶128 000的特异性多克隆抗体,抗体与疣鼻栖鸭组织中的MDIi反应滴度为1∶32 000。结论成功制备了高效价的特异性抗MDIi多克隆抗体,抗体与组织抗原有较强的免疫反应性。     

肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定

目的构建胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体。方法用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达。所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白。将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定。结果成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90%以上。ELISA确定抗体效价在1∶50000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白。结论成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体。     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定.方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21( DE3)大肠杆菌.利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白.重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价.Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性.结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600.Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α.结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

兔抗醛-酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗醛-酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法应用逆转录PCR法扩增AKR1B10全基因,将扩增产物连接到原核表达载体p ET-15b上,构建重组质粒p ET-15b-AKR1B10,将其转化至大肠杆菌E.coli DH5α中。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性者进行克隆,扩大培养,提取重组蛋白,用His-tag纯化柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔,加强免疫得到抗血清。用AKR1B10重组蛋白制备抗体纯化柱,从抗血清中纯化出抗AKR1B10多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、ELISA、Western blot法鉴定。结果成功构建了重组质粒p ET-15b-AKR1B10,并获得高纯度的重组蛋白His-Tag-AKR1B10,制备的多克隆抗体相对特异性地识别AKR1B10。结论兔抗AKR1B10多克隆抗体制备成功,特异性较好。     

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。     

犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用

目的构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定。方法应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体p ET-32a(+),构建重组质粒p ET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性。结果通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体p ET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶6 400 000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性。结论成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位

目的:构建钙整合素结合蛋白(calcium-and intesrin-binding protein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位.方法:采用RT-PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-CIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达.用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经Protein G、抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定.结果:通过重组表达获得CIB抗原蛋白,免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体,该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达;同时免疫组化结果显示:CIB在SHG44、Hhu7细胞株中主要定位于细胞质.结论:成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体,对进一步研究CIB的功能奠定了基础.     

兔抗人copine-8蛋白多克隆抗体的制备

目的制备人源copine-8(CPNE8)蛋白的多克隆抗体。方法反转录PCR扩增HBE人支气管上皮细胞的CPNE8基因(编码CPNE8蛋白)并克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,所得的重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化目的蛋白并基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。以纯化的CPNE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法检测抗体的效价和特异性。结果成功构建了p GEX-4T-1-CPNE8表达载体,重组CPNE8蛋白在大肠杆菌中高效表达。ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶64 000;此多克隆抗体可经Western blot特异性识别原核表达的CPNE8蛋白,并可适合免疫组织化学技术检测该蛋白在人正常肺组织和肺癌组织中的分布。结论成功制备具有较好结合特异性的CPNE8蛋白多克隆抗体。     

大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的制备大鼠Toll样受体2胞外段(TLR2ex,405T-573Q)的多克隆抗体并鉴定其活性。方法用反转录PCR从大鼠肝细胞中扩增长507个碱基的TLR2部分胞外段,并构建重组表达载体p ET28a-TLR2ex。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2ex-6×His融合蛋白,该蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。ELISA鉴定抗血清的效价,Western blot法检测抗血清的特异性。结果成功构建了原核表达载体p ET28a-TLR2ex,并成功表达纯化了TLR2ex-6×His融合蛋白,将该蛋白免疫BALB/c小鼠后获得抗血清;Western blot法结果显示该血清可以特异性地检出E3大鼠脾组织TLR2蛋白,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1∶76 800。结论成功制备了大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)的多克隆抗体。     

含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体。方法以重组质粒p GEX-6p-1-ADAMTS2(1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性。结果在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清。血清效价达到1∶160 000以上,且具有良好的特异性。结论成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。     

兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用北大核心CSCD

目的制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况。方法以成年小鼠睾丸组织c DNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,最终将PCR产物插入p ET-30a载体,构建p ET-30a-Tex33原核表达质粒。将原核表达质粒转化入大肠杆菌E. coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性。结果成功构建了p ET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白。ELISA检测多克隆抗体滴度为1∶1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部。结论成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达。