视网膜铺片小胶质细胞2种染色计数方法的比较

目的 比较2种视神经损伤后行视网膜铺片小胶质细胞染色计数方法的准确性.方法 取Long Evans大鼠6只,荧光金经双侧上丘及外侧膝状体逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),7d后制作视神经钳夹伤模型.钳夹伤后2周麻醉处死大鼠,将大鼠灌注固定后取眼球剥离完整视网膜,置于4％多聚甲醛中后固定2h,3只大鼠行视网膜铺片对荧光金标记的小胶质细胞进行计数,其余3只在视网膜固定后运用CD11b单克隆抗体免疫组化双重标记小胶质细胞后再行铺片计数.结果 视神经损伤后,活化的小胶质细胞吞噬了死亡RGCs碎屑而被荧光金着色,联合小胶质细胞免疫组化的染色方法能够更加清楚地在视网膜铺片上分辨出活化的小胶质细胞和存活的RGCs,荧光金标记与双重标记小胶质细胞的计数分别为(240.0±7.9)、(406.0±9.1)个/mm2.结论 运用荧光金联合免疫组化双重标记小胶质细胞能够较为准确地对视神经损伤后活化的小胶质细胞进行计数,是研究小胶质细胞更准确有效的染色方法.     

活体免疫染色评估眼底新生血管实验研究

目的 探寻更好地对视网膜新生血管(RNV)和脉络膜新生血管(CNV)及其渗漏作定性和定量分析的方法 .方法 13只小鼠随机分为RNV评估组(n=7)和CNV评估组(n=6).①RNV评估:取3只小鼠作为正常对照组,其余4只制作成未成熟视网膜病变(ROP)模型,分别于出生后第16天双眼内注射FITC标记的抗体或未经FITC标记的抗体以及空白组,12 h后直接视网膜铺片或用带荧光的二抗孵育后再铺片镜检.②CNV渗漏评估:激光诱导6只小鼠(12眼)制作CNV模型,随机平分为两组,分别于光凝后第7和14天眼内注射非荧光标记的抗体,12 h后腹腔内注射荧光素钠,并定量分析CNV面积及其渗漏面积.结果 FITC标记抗体组的视网膜表现出高荧光、高清晰度的视网膜结构血管和RNV,而非FITC标记抗体组的视网膜只选择性染色RNV,几乎无干扰荧光背景,可观察到细微变化,利于应用图像软件对RNV图片进行定性和定量分析.应用SPOT图像软件把CNV染色的图片与CNV渗漏荧光的图片进行叠加,能够明确区分CNV及其渗漏面积;第14天与第7天CNV面积及其渗漏面积比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 使用活体免疫染色技术可以方便地观察视网膜血管细微结构,并精准地定性和定量分析RNV和CNV渗漏.     

活体免疫染色评估眼底新生血管实验研究

目的 探寻更好地对视网膜新生血管(RNV)和脉络膜新生血管(CNV)及其渗漏作定性和定量分析的方法 .方法 13只小鼠随机分为RNV评估组(n=7)和CNV评估组(n=6).①RNV评估:取3只小鼠作为正常对照组,其余4只制作成未成熟视网膜病变(ROP)模型,分别于出生后第16天双眼内注射FITC标记的抗体或未经FITC标记的抗体以及空白组,12 h后直接视网膜铺片或用带荧光的二抗孵育后再铺片镜检.②CNV渗漏评估:激光诱导6只小鼠(12眼)制作CNV模型,随机平分为两组,分别于光凝后第7和14天眼内注射非荧光标记的抗体,12 h后腹腔内注射荧光素钠,并定量分析CNV面积及其渗漏面积.结果 FITC标记抗体组的视网膜表现出高荧光、高清晰度的视网膜结构血管和RNV,而非FITC标记抗体组的视网膜只选择性染色RNV,几乎无干扰荧光背景,可观察到细微变化,利于应用图像软件对RNV图片进行定性和定量分析.应用SPOT图像软件把CNV染色的图片与CNV渗漏荧光的图片进行叠加,能够明确区分CNV及其渗漏面积;第14天与第7天CNV面积及其渗漏面积比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 使用活体免疫染色技术可以方便地观察视网膜血管细微结构,并精准地定性和定量分析RNV和CNV渗漏.     

CFSE标记的内皮祖细胞在激光损伤的小鼠视网膜中的示踪研究

背景 探讨羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的内皮祖细胞（EPCs）在激光损伤视网膜小鼠模型中示踪的体内外研究。 方法 从人脐带血中分离、培养EPCs,并进行鉴定。应用不同浓度的CFSE标记EPCs,通过荧光强度和对细胞的毒性检测,选定最佳标记条件。采用Trypan blue拒染法和Annexin V/PI染色法测定标记后EPCs的生存能力和凋亡率的变化。荧光显微镜下观察标记荧光随培养时间的变化情况。利用视网膜激光光凝制作小鼠视网膜损伤模型,并将标记的EPCs注射到其玻璃体腔内进行示踪研究。Evans蓝灌注血管造影及视网膜铺片观察标记细胞在视网膜的分布情况。 结果 研究结果表明5 μM CFSE为标记EPCs最佳条件,标记的细胞呈现明亮的绿色荧光,并保持良好的细胞形态。在标记2天、1周和4周内,检测生存能力及凋亡率较未标记的细胞没有明显变化,但标记荧光的强度在4周内逐渐下降。Evans蓝灌注血管造影可清晰显示视网膜毛细血管网的结构,激光斑处可见荧光渗漏。移植标记的EPCs1周后,可见荧光标记的细胞在激光斑周围聚集,移植后4周可在视网膜血管网中观察到类似管状的荧光结构形成。 结论 活体染料CFSE可在体外标记EPCs,并在体内示踪至少4周,进一步证实EPCs可能参与损伤视网膜血管的修复。     

离体电转染pCAGGS．EGFP对小鼠视网膜神经节细胞的标记

目的：通过离体电转染将GFP对胚胎期小鼠视网膜神经节细胞（RGC）进行标记来观察其形态．方法：剥离胚胎小鼠E14的视网膜连同晶状体,放入定制的电转杯中进行电转染,以8～16V电压将pCAGGS—EGFP质粒导入RGC,体外培养视网膜1～5d,观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况。结果：以12V,50ms,950InS的间隔,5个脉冲转染效率最高,为81．25％：20～144h期间GFP依次由胞体向轴突、树突扩散分布。结论：在体外培养基中培养1～5d．pCAGGS—EGFP经过最适电压转染后能够在小鼠视网膜神经节细胞中持续扩散表达.     

人骨髓间充质干细胞向骨骼肌定向分化的研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞在裸鼠损伤腿部向骨骼肌定向分化。方法 在裸鼠腿部注入无水酒精造成肌肉损伤，取培养人骨髓间充质干细胞用荧光染料Dil标记后注入损伤处，术后6d及12d取损伤部肌肉进行形态观察和免疫荧光标记。结果 在术后6d可见Dil标记细胞向骨骼肌分化，Myoglobin阳性表达。术后12d后可见新生骨骼肌出现典型横纹，细胞核MyoD1阳性表达。结论 在裸鼠损伤肌肉的微环境中，人骨髓间充质干细胞可向骨骼肌定向分化，并伴有Myoglobin及MyoD1阳性表达。     

DiI染色方法观察视网膜神经节细胞形态

目的 寻求一种简单易行的观察视网膜神经节细胞形态学的染色方法.方法 取30 d(P30)Long Even's大鼠6只,雌雄不限,麻醉处死,取眼球后剥离完整视网膜,置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h,取固定好的视网膜行全视网膜铺片后DiI荧光染色,将视网膜再次置于4%多聚甲醛溶液中避光37 ℃固定,6 d后观察神经节细胞形态.结果 染色可见神经节细胞胞体清晰,树突及轴突均匀着色,形态清晰.结论 视网膜铺片行DiI染色可以较好的观察神经节细胞形态.     

视网膜血管铺片技术的改进

目的 探讨视网膜血管铺片技术的改进及在实验动物小鼠, 大鼠, 狗和猴中的应用。方法 应用蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片, 行HE及PAS染色观察血管形态, 免疫组化方法观察CD31及VEGF的表达。结果 用改进方法制备的视网膜血管铺片, 血管网完整, 无神经组织残留, 可清晰显示血管走向。各级血管形态清晰, 血管分支清楚完整, 无断裂现象。血管内皮细胞形态清晰。CD31在血管周细胞及内皮细胞均有表达;VEGF主要在内皮细胞表达。结论 改进的视网膜血管铺片技术可成功应用于不同实验动物, 为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。     

Akt抑制剂对氧诱导视网膜新生血管形成的作用

目的:观察Akt抑制剂对低氧环境下视网膜新生血管形成的抑制作用,探讨Akt活性的抑制对于新生血管抑制的作用。方法:将鼠龄为7 d的C56BL/6J小鼠14只置于浓度为(75±2)%高氧舱环境中生活5 d,然后返回正常氧环境中。14只小鼠于出氧舱后当日被随机平均分为实验组和对照组各7只,实验组小鼠玻璃体腔内注射1.5μl Akt抑制剂,对照组小鼠玻璃体腔内注射1.5μl PBS。在P17,实验组和对照组小鼠FITC-Dextran左心室造影视网膜铺片了解视网膜的血管形态的改变以及小鼠组织学切片观察突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量。结果:视网膜铺片结果显示实验组与对照组相比较,视网膜可见新生血管芽,但是新生血管丛数量及面积明显减少,荧光渗漏明显减轻,但无灌注区无明显的减小;组织学切片结果表明与对照组相比较,Akt抑制剂注射实验组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量明显减少,实验组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量为(14±3.0)个,对照组为(55±3.0)个,差异具有统计学意义(P=0.001)。结论:在缺氧环境下运用Akt抑制剂能够抑制视网膜新生血管的发生,但Akt抑制剂不减少无灌注区的面积。     

雌激素受体GPR30介导的小鼠视网膜神经节细胞保护作用

目的:通过玻璃体腔注射N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)建立小鼠青光眼模型,研究G蛋白偶联受体30(GPR30)对受损的视网膜神经节细胞的保护作用。方法:选取7-9周龄C57雄性小鼠,利用荧光染色技术,观察GPR30受体在正常雄鼠视网膜内分布。将健康雄鼠随机分为4组:1对照组;2NMDA模型组;3GPR30受体激动剂(G-1)组;4雌激素和GPR30受体拮抗剂(G-15)组。通过全视网膜铺片Brn3a免疫荧光染色、视网膜冰冻切片免疫荧光染色和神经节细胞计数,观察玻璃体腔注射NMDA后各组小鼠视网膜神经节细胞和视网膜胶质细胞的变化。结果:在正常雄鼠视网膜中,GPR30受体主要表达在内核层和神经节细胞层。光镜下观察雌激素组和G-1组中Brn3a特异性标记的神经节细胞较NMDA模型组神经节细胞密度增高,GFAP标记的胶质细胞较NMDA模型组则明显减少;神经节细胞计数显示:雌激素组和GPR30受体激动剂(G-1)组均较NMDA模型组神经节细胞数量明显增高(P<0.05)。结论:雌激素主要通过激活GPR30受体保护视网膜神经节细胞,在NMDA损伤的视网膜神经节细胞模型中,GPR30受体的激活可减少视网膜胶质细胞的增生。