甲状腺激素受体蛋白的纯化 Ⅲ.离子交换层析法

本文对大鼠肝细胞核内甲状腺激素(T_3)受体蛋白用离子交换层析法进行了部分纯化。自成年DS大鼠肝制备肝细胞核,经含Triton-X100缓冲液洗净后,用含0.4mol/L KCl的Tris缓冲液,pH7.85,提取出可     

小鼠胸腺皮质酸性对硝基酚磷酸酶的细胞化学定位

用6周BALB/c小鼠,取胸腺皮质切成1mm~3小块,固定于含5％蔗糖的2％(戊二醛二甲胂酸(pH 7.2)中。经0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液洗后,用振动切片机切成40 μm厚片。再经0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)漂洗,入孵育液;3.0 mmol/L对硝基酚磷酸钠,2.0 mmol/L氯化亚铈,0.1mmol/L醋酸缓冲液(pH5.5),含5％蔗糖     

结直肠癌相关抗原的纯化及分析

<正>肿瘤细胞相关抗原对肿瘤临床诊断及预后监测具有重要意义.近年来应用单克隆抗体技术,鉴定出许多肿瘤相关抗原.目前在临床上应用的结直肠癌标志物除CEA外,还有CA19-9、结直肠癌相关抗原(CCA)等.本文采用鼠抗人结直肠癌单克隆抗体纯化结肠癌组织中的CCA,并对此抗原作初步分析.1 材料与方法1.1 可溶性抗原的制备 人结肠癌组织用生理盐水洗净.将肿瘤组织剪成小块,加入0.01mol/LpH7.2(含3mol/L氯化钾)磷酸缓冲液,制成匀浆.4℃搅拌14h.10000r/min离心30min,上清液用上述缓冲液透析48h.将此提取液边搅拌边滴加3mol/L 高氯酸,至其最终浓度成0.6mol/L,4℃搅拌30min,10000r/min离心30min,上清液透析,稍作浓缩.测定蛋白浓度为2.5×10~2mg/ml.1.2 单抗亲和层析柱的制备和亲和纯化CCA将抗CCA单克隆抗体腹水(IgGl,中国科学院细胞生物研究所提供)经二次盐析后,用pH8.3 0.1mol/L 碳酸缓冲液透析平衡.每毫升 CNBr活化Sepharose 4B凝胶加20mg抗体蛋白混合.室温倒转反应2h,继用1mol/L.pH7乙醇胺封闭2h,制成单抗亲和层析柱.最后用0.15mol/L pH7.2磷酸缓冲液平衡,装柱.将上述高氨酸提取液上亲和层析柱.解高用0.2mol/L pH2.5甘氨酸-HCI缓冲液,收集并及时中和所得抗原蛋白液.1.3 免疫酶法测定 取市售的CCA试剂盒(中科院及本     

大鼠中央杏仁核内亮氨酸脑啡肽的分布

雄性Wistar大鼠6只,复合麻醉剂(Chloroper t)腹腔注射麻醉(3ml/kg),经左心室-升主动脉插管快速灌入生理盐水50m1,随后灌注1%多聚甲醛、0.2%苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4,4℃)300ml,30min灌完。立即取脑,入同样固定液后固定2h(4℃),置入含30%蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液内(4℃)24h。恒冷箱连续冠状切片(厚48μm)。0.01mol/L PBS接片。第1抗体为兔抗L-ENK血清(INC产品),用ABC(Vector产品)程序孵育切片,DAB法呈色。对照实验采用替换实验和吸收实验,结果为阴性。     

内皮素1和血管紧张素Ⅱ对大鼠肝细胞核核苷三磷酸酶活性的影响

核被膜核苷三磷酸酶 (nucleosidetriphosphatase ,NTPase)为通过细胞核孔复合体转运mRNA的限速酶。本实验探讨内皮素 1(ET 1)和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对大鼠肝细胞核NTPase活性的影响。体外分离的大鼠肝细胞核与ET 1或AngⅡ单独或分别与ET 1的ETA受体拮抗剂JKC30 1、ETB受体拮抗剂BQ788或AngⅡ的AT1受体拮抗剂Losartan、AT2 拮抗剂PD12 3177共同孵育肝细胞核 ,分别测定ATP和GTP作底物时 ,肝细胞核NTPase活性。结果发现ATP和GTP作底物时 ,ET 1(10 -11～ 10 -9mol/L)或AngⅡ (10 -11～ 10 -9mol/L)孵育肝细胞核均浓度依赖地增强其NTPase活性 (均P <0 0 1) ,ET 1和AngⅡ对NTPase的刺激作用可分别被JKC30 1(10 -6mol/L)和Losartan (10 -6mol/L)阻断 (P <0 0 1)。ET 1和AngⅡ共同孵育后 ,核NTPase活性与ET 1或AngⅡ单独孵育相比显著增加 (均P<0 0 1)。结果表明 :ET 1和AngⅡ可分别通过ETA和AT1受体刺激肝细胞核NTPase活性     

Zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和信号转导通路

目的:探讨5-HT4受体激动剂兼5-HT3受体阻断剂zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和细胞信号转导机制.方法:应用全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜IK1电流,分别观察10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT3受体激动剂间氯苯双胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制剂 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制剂GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制剂 KT5823对zacopride 增强IK1的影响.结果:10 μmol/L 5-HT4受体阻断剂RS23597-190本身可抑制IK1电流,在预先应用RS23597-190的基础上,1 μmol/L zacopride仍可明显激动IK1通道,使其内向电流(-100 mV)增强32.5% (P< 0.05).10 μmol/L 5-HT3受体激动剂m-CPBG对IK1电流无明显影响,也不能逆转1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P> 0.05).此外,5 μmol/L PKA 阻断剂 KT5720能显著抑制1 μmol/L zacopride对IK1的增强效应(P< 0.05),而PKC 阻断剂GF109203x和PKG阻断剂KT5823则对1 μmol/L zacopride的效应无明显影响(P> 0.05).结论:Zacopride对 IK1的增强作用可能经由PKA介导的信号转导通路,而不依赖于5-HT3和5-HT4受体.     

5-羟色胺诱导冠状动脉收缩的机制研究

目的:探讨5-羟色胺(5-HT)诱导冠状动脉收缩的机制。方法:取雄性Wistar成年大鼠,制备离体冠状动脉环,经血管张力测定仪测定动脉环的张力变化,并探讨给予不同信号通路抑制剂对5-HT诱导的冠状动脉收缩的影响。结果:首先发现给予5-HT_(2A)受体阻断剂沙格雷酯(sarpogrelate,1μmol/L)可完全消除5-HT引起的冠状动脉浓度依赖性收缩;磷脂酶C_β(PLC_β)抑制剂U73122(10μmol/L和50μmol/L)、Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632(3μmol/L和10μmol/L)和蛋白激酶Cδ亚基(PKCδ)抑制剂rottlerin(3μmol/L和10μmol/L)孵育后,均可明显抑制5-HT引起的冠状动脉环收缩(P0.05);此外,L-型钙通道(Cav1.2)阻断剂硝苯地平(1μmol/L)及细胞内钙池操纵性钙内流(SOCE)抑制剂SKF96365(10μmol/L和30μmol/L)和2-氨基乙氧基苯硼酸(2-APB,50μmol/L和100μmol/L)孵育后,5-HT诱导的血管收缩张力较未处理组明显下降(P0.05);另外,在含硝苯地平(1μmol/L)的无钙Kerbs-Henseleit(K-H)液中,发现5-HT仍可诱导血管收缩。结论:5-HT通过激活5-HT_(2A)受体诱导冠状动脉收缩,其机制可能与PKC和Rho激酶信号通路,以及钙调控有关。     

荧光抗体标记技术的改进

<正> 用荧光标记抗体,事先需将抗体纯化。而我们在实践中发现,直接标记全血清也会产生满意的效果,现报告如下。 取驴抗兔血清2ml,用pH7.4的0.01mol/LPBS稀释一倍后装入透析袋,放入FITC溶液(2.5mg FITC溶于200ml pH9.5的0.1mol/L碳酸盐缓冲液)中,4℃,24小时,继而通过Sephadex G-25(柱体积为70ml,洗脱液为pH7.4的0.01mol/L PBS)层析,除去游离荧光素和其他未标记成份,如此即得所需的标记抗体。     

应用MARS人工肝治疗急慢性重型肝炎临床研究

探讨分子吸附再循环系统(MARS)人工肝支持系统治疗重型肝炎的疗效和安全性。方法7例重型肝炎患者在内科综合治疗同时,加用MARS人工肝治疗。MARS人工肝治疗每次持续6～8h。结果7例重型肝炎患者在MARS治疗后,血总胆红素和总胆酸分别由(410.90±256.99)μmol/L和(107.37±69.78)μmol/L降至(310.60±88.97)μmol/L和(60.96±36.27)μmol/L(P<0.001);肌苷和尿素分别由(234.43±90.83)mmol/L和(12.64±5.29)mmol/L降至(93.29±45.27)mmol/L和(6.59±3.73mmol/L(P<0.05);凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)分别由(26.81±)13.01s)和(57.54±18.44)s缩短至(17.98±4.52)s和(40.57±11.14)s(P<0.05MARS治疗前后患者血K 、Na 、白细胞和);血小板无显著改变(P>0.05);在MARS治疗期间患者血压、脉搏稳定。4例合并肝肾综合征(HRS)患者中,2例经MARS治疗病情好转,肾功能改善。结论MARS人工肝支持系统是治疗重型肝炎及合并HRS有效和安全的方法。     

Delta阿片受体激活对体外培养大鼠软骨细胞凋亡的影响

目的:研究delta阿片受体激活对体外培养新生大鼠软骨细胞凋亡的影响并探讨其机制.方法:体外分离培养新生大鼠软骨细胞,用delta阿片受体进行干预,MTT法测定细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡;免疫印迹分析caspase-3和细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达水平.结果:delta阿片受体激动剂DADLE(1 μmol/L)可增强软骨细胞ERK蛋白的磷酸化,抑制软骨细胞凋亡,但这种现象可被delta阿片受体阻断剂Naltrindole(10μmol/L)所逆转,并且给予ERK特异性抑制剂U0126(10 nmol/L)亦可逆转DADLE抑制细胞凋亡的作用.结论:Delta阿片受体激活可抑制大鼠软骨细胞凋亡,其机制可能与激活ERK途径相关.     

高钾溶液对猪冠状动脉内皮细胞功能影响的实验研究

目的 :探讨高钾溶液对猪冠状动脉内皮细胞功能的影响及其机制。方法 :取新鲜猪心外膜下冠状动脉前降支下三分之一 ,切成 3mm长的血管环。采用器官槽法 ,分别用Krebs Henseleit重碳酸盐缓冲液 (KH)、2 0mmol/L的高钾溶液、50mmol/L的高钾溶液浸泡血管环 1h后 ,检测在 7μmol/L环加氧酶阻断剂消炎痛、3 0 0 μmol/L一氧化氮合成酶阻断剂N 硝基 L 精氨酸、1mmol/L钙激动性钾通道阻断剂四乙胺、或 3μmol/LATP敏感性钾通道阻断剂优降糖的作用下 ,3 0nmol/L前列腺素F2α引发的预收缩强度和非受体介导钙离子载体 ( 10 -1 0 ～ 10 -6mol/L)引发的内皮源性舒张反应。结果 :与单纯浸泡于KH的冠状动脉相比 ,内皮源性超极化因子 (EDHF)介导的内皮源性舒张反应 ,经 2 0mmol/L、50mmol/L高钾溶液及四乙胺作用后显著降低 ,但加入优降糖后改变不明显。结论 :EDHF在冠状动脉内皮源性舒张中起重要的作用 ,高浓度钾离子抑制EDHF的作用、EDHF介导血管舒张的作用过程主要与钙激动性钾通道有关     

血管紧张素II和洛沙坦对肝星状细胞合成胶原的影响

目的 :探讨血管紧张素II及其 1型受体 (AT1a)拮抗剂洛沙坦 (losartan) ,对肝星状细胞合成胶原的影响。方法 :①大鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定 ;②在不同浓度的血管紧张素II和洛沙坦作用下 ,采用 [3 H]-脯氨酸掺入释放法分别检测肝星状细胞生成胶原的情况。结果 :①细胞得率为 2× 10 7- 3× 10 7个 /只 ,活力在 95 %以上 ,纯度超过 90 %。②血管紧张素II在浓度为 10 -6mol/L - 10 -10 mol/L时 ,肝星状细胞生成胶原明显增多 (P <0 0 5 ) ;血管紧张素II浓度与胶原量呈正相关 (r=0 96 0 ,P <0 0 1)。洛沙坦在浓度为 10 -6mol/L - 10 -9mol/L时 ,胶原生成量显著减少 (P <0 0 5 ) ;且浓度与胶原生成量呈负相关 (r=- 0 882 ,P <0 0 1)。结论 :血管紧张素II可以促使肝星状细胞产生大量的胶原 ;洛沙坦通过拮抗AT1a后 ,胶原合成量显著减少 ,提示血管紧张素II在促使肝纤维化的发展过程中起着重要的作用 ,AT1a的拮抗剂有望为阻止肝纤维化发展提供新策略     

Zacopride增强心肌内向整流钾电流(IK1)效应的受体和信号转导通路

目的: 探讨5-HT₄受体激动剂兼5-HT₃受体阻断剂zacopride增强心肌内向整流钾电流(I_K1)效应的受体和细胞信号转导机制。方法: 应用全细胞膜片钳技术记录大鼠心室肌细胞膜I_K1电流,分别观察10 μmol/L 5-HT₄受体阻断剂 RS23597-190、10 μmol/L 5-HT₃受体激动剂间氯苯双胍(m-CPBG)、5 μmol/L PKA 抑制剂 KT5720、5 μmol/L PKC 抑制剂GF109203x 和 5 μmol/L PKG抑制剂 KT5823对zacopride 增强I_K1的影响。结果: 10 μmol/L 5-HT₄受体阻断剂RS23597-190本身可抑制I_K1电流,在预先应用RS23597-190的基础上,1 μmol/L zacopride仍可明显激动I_K1通道,使其内向电流(-100 mV)增强32.5% (P< 0.05)。10 μmol/L 5-HT₃受体激动剂m-CPBG对I_K1电流无明显影响,也不能逆转1 μmol/L zacopride对I_K1的增强效应(P> 0.05)。此外,5 μmol/L PKA 阻断剂 KT5720能显著抑制1 μmol/L zacopride对I_K1的增强效应(P< 0.05),而PKC 阻断剂GF109203x和PKG阻断剂KT5823则对1 μmol/L zacopride的效应无明显影响(P> 0.05)。结论: Zacopride对 I_K1的增强作用可能经由PKA介导的信号转导通路,而不依赖于5-HT₃和5-HT₄受体。     

去顶术后复发的肝脏黏液性囊性肿瘤1例

患者女性,45岁,1年前因“肝囊肿”行去顶术,术后恢复可,近来患者出现进食不佳,CT示肝囊性病灶(图1),血液谷草转氨酶(AST):43 U/L;总胆红素(TBIL):26.1μmol/L;间接胆红素(IDBIL):20.6μmol/L。行腹腔镜“肝囊肿”切除术,术后将囊壁组织送病理检查。     

AZD4547促进自噬并促进索拉非尼耐药肝癌细胞的死亡

目的研究成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂AZD4547对索拉非尼耐药肝癌细胞死亡的影响及机制。方法构建Huh7R索拉非尼耐药肝癌细胞株,分为对照组、 12μmol/L索拉非尼处理组、 5μmol/L AZD4547处理组、 12μmol/L索拉非尼联合5μmol/L AZD4547处理组。CCK-8法检测细胞存活率, Western blot法检测FGFR、 Toll样受体4(TLR4)及微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、 beclin 1、 P62的蛋白水平。利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)验证AZD4547联合索拉非尼诱导索拉非尼耐药的肝癌细胞死亡的机制。结果 AZD4547联合索拉非尼显著降低Huh7R耐药肝癌细胞的存活率; AZD4547抑制FGFR活性,且该药物联合索拉非尼显著增加Huh7R细胞的LC3Ⅱ/Ⅰ、 beclin 1蛋白水平、降低P62蛋白水平,并上调TLR4蛋白表达。3-MA抑制自噬可逆转AZD4547联合索拉非尼对Huh7R细胞的杀伤效应。结论 AZD4547抑制FGFR活性可显著增强索拉非尼耐药肝癌细胞的自噬及免疫应答水平,促进耐药肝癌细胞死亡。     

人工肝技术治疗前后慢性重症乙肝患者血清IL-18、总胆红素的变化及其临床意义

目的:检测人工肝治疗前、后,重症乙型肝炎患者血清IL-18、总胆红素、γ-球蛋白(γG)水平的变化,分析人工肝技术清除病理性有害物质的功能。方法:34例慢性重症乙型肝炎患者分为两组,18例为人工肝治疗组,进行人工肝 内科综合治疗;16例为对照组,只进行内科综合治疗,血清IL-18、总胆红素及γG的水平,分别采用ELISA法、Beck-manCX4生化仪及Sebia电泳仪进行检测。结果:人工肝治疗组治疗前、后,血清IL-18的含量分别为(499.11±230.24)ng/L和(313.78±83.28)ng/L,差异显著(P<0.05);对照组治疗前、后血清IL-18的含量分别为(477.89±163.79)ng/L和(373.73±148.41)ng/L,差异无统计学意义(P>0.05)。人工肝治疗组治疗前、后,血清总胆红素含量的均值分别为(555.01±17.81)μmol/L和(305.92±62.19)μmol/L;差异显著(P<0.05)。血清γG均值分别为(23.8±12.41)g/L和(22.47±2.28)g/L,无统计学意义(P>0.05)。对照组治疗前、后血清总胆红素含量的均值分别为(543.12±21.77)μmol/L和(513.55±15.58)μmol/L;血清γG均值分别为(21.66±13.48)g/L和(21.96±5.88)g/L,均无统计学意义(P>0.05)。结论:人工肝技术可有效地清除重肝乙肝患者体内IL-18、总胆红素等病理性物质,提高患者的存活率,为肝移植的治疗争取了时间。     

奥美拉唑对家兔肾脏内髓集合管细胞H+/K+交换功能的影响

目的探讨奥美拉唑对家兔肾脏IMCD细胞H+/K+交换的影响,以及经洗涤处理是否解除这种影响.方法原代培养家兔肾脏IMCD细胞单层,在100 μmol/L奥美拉唑缓冲液中孵育25 min, 洗涤组则在奥美拉唑缓冲液孵育后,用不含奥美拉唑的缓冲液洗涤IMCD细胞;对照组在不含奥美拉唑的缓冲液孵育25 min;CECF/AM荧光探针法测定各组IMCD细胞H+/K+交换.结果奥美拉唑组的H+/K+交换为(0.016±0.006) dpHi/min(n=8);与对照组的(0.053±0.008) dpHi/min(n=8)相比,相差非常显著(P<0.001);洗涤组的H+/K+交换为(0.016±0.006) dpHi/min(n=6),与对照组(n=6)的(0.052±0.009)dpHi/min相比,相差非常显著(P<0.001).结论 100 mol/L的奥美拉唑对家兔IMCD细胞的H+/K+交换有显著影响,而且洗涤处理不能解除这种抑制.因而,肺心病合并上消化道出血患者使用奥美拉唑时,应综合考虑其利弊.     

α3β2与α3β4烟碱型乙酰胆碱受体α和β亚基不同配比的药理活性研究

目的:比较α和β亚基不同配比形成α3β2和α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)敏感性的差异。方法:体外转录获得α和β亚基的cRNA,采用显微注射将3种不同配比(α∶β分别为1∶10、1∶1和10∶1)的cRNA注入非洲爪蟾卵母细胞,利用双电极电压钳检测受体表达情况。利用激动剂乙酰胆碱(ACh)和拮抗剂α-芋螺毒素Reg IIA(α-CTx Reg IIA)检测在3种配比条件下形成受体药理活性的差异。结果:对于α3β2 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的半数有效浓度(EC50)分别为91.2μmol/L、104.4μmol/L和130.6μmol/L,α-CTx Reg IIA的半数抑制浓度(IC50)分别为40.2 nmol/L、36.4 nmol/L和42.3 nmol/L。对于α3β4 nAChR亚型,在3种配比情况下,ACh的EC50分别为44.0μmol/L、110.0μmol/L和230.0μmol/L,α-CTx Reg IIA的IC50分别为226.8 nmol/L、71.5 nmol/L和49.4 nmol/L。结论:α3和β4亚基比例的改变会导致α3β4 nAChR结构和药理活性的改变。α3和β2亚基比例的改变对α3β2 nAChR结构和活性没有影响。     

去甲肾上腺素对体外肝星状细胞系凋亡的影响

目的探讨交感神经递质去甲肾上腺素(NE)对体外培养的肝星状细胞(HSCs)凋亡的影响。方法体外培养HSCs,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测NE对HSCs增殖的影响;原位杂交凋亡检测(TUNEL)法观察NE及各受体亚型的阻滞剂对HSCs凋亡的影响;流式细胞术检测凋亡率。结果(1)不同浓度NE均促进HSCs增殖,并呈时间依赖性;NE浓度为10μmol/L时促增殖作用最显著;(2)10μmol/L浓度NE作用于HSCs24h,TUNEL和流式细胞术检测HSCs凋亡率均显著低于对照组(P<0.05);(3)加入各肾上腺素受体(AR)阻滞剂后HSCs凋亡率升高,其中α-AR和β2-AR阻滞剂作用最显著。结论交感神经递质NE对体外活化的HSCs具有促增殖作用,并可以抑制HSCs凋亡,主要是通过α-AR和β2-AR起作用的。     

蛇床子素通过上调抑癌基因PTEN 抑制肝癌细胞HepG2 增殖并促进细胞凋亡

目的:探究蛇床子素对肝癌细胞Hep G2增殖及凋亡的作用及作用机制。方法:用不同浓度蛇床子素处理肝癌细胞,CCK8检测细胞活性,流式检测细胞凋亡,Western blot检测细胞增殖、凋亡标记蛋白及PTEN的表达;同时用PTEN抑制剂bp V(HOpic)处理细胞,CCK8和流式再次检测细胞增殖及凋亡情况。结果:100μmol/L蛇床子素作用4 d和5 d能明显降低细胞增殖倍数(P0. 05),150μmol/L蛇床子素作用3 d、4 d和5 d也可显著降低细胞增殖倍数(P0. 05,P0. 01),并且蛇床子素(100μmol/L,150μmol/L)还能显著抑制细胞增殖标记蛋白Ki67和PCNA的表达,并体现量效关系(P0. 05,P0. 01);同时,蛇床子素(100μmol/L,150μmol/L)能明显促进肝癌细胞凋亡及凋亡标记蛋白Bax表达,降低Bcl-2蛋白表达水平(P0. 05,P0. 01);此外,蛇床子素(100μmol/L,150μmol/L)还能显著促进抑癌基因PTEN的表达(P0. 05,P0. 01);bp V(HOpic)能明显减弱蛇床子素对肝癌细胞增殖的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用(P0. 05)。结论:蛇床子素能通过上调PTEN表达抑制肝癌细胞Hep G2增殖、促进肝癌细胞凋亡。