早孕绒毛细胞滋养层细胞分离培养的实验研究

目的改善体外分离和培养人早孕绒毛细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)的方法,探讨CTB的一些生物学特性.方法取人工流产6～8周妊娠绒毛,机械法分离,酶消化,经Ficoll分离介质离心得到单个核细胞进行培养并鉴定,测定其生长曲线并观察其体外转化、细胞周期和激素合成.结果分离培养的CTB经免疫细胞化学染色鉴定,接种后2 h开始贴壁,第5天融合90%以上,细胞周期显示约有79%细胞处于G0/G1期,激素分泌表现出随CTB的转化而变化.结论成功分离培养了人早孕绒毛CTB,方法简便易行,获得的细胞形态单一、生长稳定、定向转化,为进一步研究CTB在生殖生理中的作用提供了实验基础.     

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠６～１０周的人妊娠早期绒毛膜,用胰酶／ＤＮＡ酶消化,换瓶纯化处理,经光镜和电镜检测证实,我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。     

人胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的 建立纯度较高的适于试验研究的人绒毛膜滋养层细胞。方法 胰蛋白酶-DNase联合消化法培养人绒毛膜滋养层细胞，间接免疫染色进行细胞鉴定。透射电镜观察细胞内部结构。结果 倒置显微镜下，可见细胞呈不规则多角形，核大卵圆形，胞质透明，呈片状铺展生长，角蛋白染色阳性率超过95%，未检测到波形蛋白阳性细胞，表明不含污染细胞。透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构。结论 该法简便易行，可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养,胰蛋白酶消化法行传代培养,免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时,细胞开始由组织块边缘向外生长;１５ｄ时,即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的 培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法 用组织块法行原代培养,胰蛋白酶消化法行传代培养,免疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果 ６ｄ时,细胞开始由组织块边缘向外生长;１５ｄ时,即可进行传代。角蛋白染色示细胞纯度达９５％以上。结论 组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行,可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。     

乙型肝炎病毒感染原代培养人绒毛膜滋养层细胞的实验研究

目的探讨原代培养的人绒毛膜滋养层细胞感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的可能性及规律。方法采用胰酶/DNA酶序贯消化及Percoll密度梯度离心分离纯化人绒毛膜滋养层细胞后,采用血清直接感染法进行滋养层细胞的HBV感染,同时通过与对正常成人肝细胞株L02细胞的HBV感染后及转染HBV的肝癌细胞株（HepG2.2.15）的传代培养比较,实时荧光定量PCR检测培养上清的HBV DNA;并用透射电镜观察HBV感染后滋养层细胞的超微结构改变及其在滋养层细胞中的定位。结果原代培养的滋养层细胞感染HBV后释放至培养上清中的HBV DNA于感染后48-72h达高峰,而L02细胞则于感染后12-24h达高峰,HepG2.2.15细胞株感染后则一直攀升。透射电镜观察HBV感染后滋养层细胞超微结构发生了明显改变,主要表现为溶酶体大量增生,出现空泡状结构,并可观察到病毒样颗粒,主要定位于细胞核周。结论HBV可以感染滋养层细胞,定位于核周并导致滋养层细胞的超微结构改变。     

人早孕胎盘绒毛膜滋养层细胞的培养

目的: 培养纯度较高的人绒毛膜滋养层细胞, 为胎盘绒毛在妊娠期间的作用及其机制研究提供细胞学基础.方法: 胰蛋白酶-DNase消化法培养人绒毛膜滋养层细胞,间接免疫染色进行细胞纯度检测,透射电镜观察细胞内部结构.结果: 倒置显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波型蛋白染色阴性,表明不含污染细胞.透射电镜观察示所获细胞有典型滋养层细胞结构.结论: 该法简便易行,可获得合乎试验要求的人绒毛膜滋养层细胞.     

原代人绒毛滋养层细胞分离培养及其对巨细胞病毒的易感性研究

目的通过分离培养原代人绒毛滋养层细胞(HTCs)并检测其对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径。方法将30例健康孕妇经负压真空吸引手术所得的流产早孕绒毛组织充分剪碎,用0.25%胰蛋白酶和0.2%DNA酶混合消化法制备细胞悬液,细胞悬液经200目不锈钢筛网过滤后用Percoll液密度梯度离心对HTCs进行初步纯化,细胞传代中应用反复胰酶消化法对HTC进行3～5次纯化,通过细胞学形态观察和免疫荧光染色方法对HTCs进行鉴定;用HCMV病毒株体外感染HTCs,应用PCR、Westernblot和免疫荧光方法对HCMV基因及蛋白进行检测,从而确定HTCs对HCMV的易感性。结果 Percoll分离联合胰酶、DNA酶消化法对原代HTCs有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明90%以上细胞表达CK-7相关抗原,HTCs体外感染HCMV 72h后形态学发生明显改变,病毒基因及蛋白均呈阳性表达。结论原代HTCs对HCMV易感,通过HTCs感染胎儿可能是HCMV宫内感染的重要传播途径之一。     

绒毛外细胞滋养层细胞体外侵袭模型的建立

目的 建立绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)体外侵袭模型,为探讨滋养层细胞侵袭调节机制提供实验平台.方法 取健康早孕妇女(孕7～9周)人工流产绒毛组织,利用Percoll梯度离心法及差速贴壁法,将纯化的绒毛外滋养层细胞,按所需浓度接种于涂有Matrigel培养板或24孔Transwell侵入系统中培养.用细胞免疫荧光法检测TGFβ2、cytokeration 7、integrin α1β1.用CCK-8评价细胞生长状况.用Transwell细胞侵入系统检测EVCT的体外侵袭作用.结果 EVCT在Matrigel包被的Petri皿培养4h,用细胞免疫荧光法显示有95%以上的细胞表达TGFβ2、cytokeration 7,integrin α1β1.EVCT在Matrigel培养不同时间后,其生长指数未有明显变化,提示Matrigel对EVCT的生长未见明显影响.EVCT在Transwell侵袭系统中培养不同时间后,根据侵袭细胞的OD值,提示48h细胞侵袭作用达到平台期.结论 本实验成功地建立了EVCT体外侵袭模型,可利用此模型研究滋养层细胞的侵袭机制.从而为研究妊娠生理、妊娠病理、妊娠免疫耐受及正常细胞到肿瘤细胞之间的转化提供了实验平台.     

大鼠角朊细胞的无滋养层培养

目的 :探索一种新的表皮角朊细胞 (角蛋白细胞 ,KCs)的培养方法。方法 :应用含有新生牛血清并附加多种调节因子的 DMEM- F1 2培养基 ,对大鼠表皮 KCs进行无滋养层法培养。结果 :大部分 KCs在接种后 36h贴壁 ,并有集落形成。培养至第 9天 ,细胞接近铺满单层。结论 :采用无滋养层法培养大鼠 KCs不仅可行 ,而且具有细胞成活率高、避免滋养层细胞影响等优点。为构建组织工程人工皮肤提供了理想的种子细胞     

早孕绒毛滋养层细胞体外培养方法的改良

目的 建立一种重复性好、能快速简便获得高纯度滋养细胞的培养方法.方法 取孕6～8周正常绒毛组织40例,分别采用组织贴块法、酶消化法和改良联合法进行原代培养.结果 改良联合法培养的细胞生长迅速,接种6～8d即可传代,原代细胞生长时间明显缩短,细胞纯度达90%.结论 改良联合法综合了组织贴块法和酶消化法的优点,可快速获得实验所需的人绒毛膜滋养层细胞.     

蜕膜细胞条件培养液对滋养细胞侵袭调节基因表达的影响

目的　探讨蜕膜细胞条件培养液（DCM）对滋养细胞侵袭调节基因表达的影响。方法　用体外培养早孕、晚孕蜕膜细胞的方法制备DCM,然后将其处理体外培养的早孕滋养细胞。用半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析早孕滋养细胞侵袭调节基因表达的变化。结果　正常培养的早孕滋养细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制物（TIMP-1）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（u-PA）mRNA均有表达;而TIMP-2、纤溶酶原激活因子抑制因子（PAI-1）mRNA未见表达。早孕和晚孕DCM均能下调滋养细胞MMP-2、MMP-9、u-PAmRNA的表达,而上调TIMP-1mRNA的表达。早孕、晚孕DCM均能诱导滋养细胞PAI-1mRNA的表达,但对TIMP-2mRNA的表达未见有影响。结论　蜕膜细胞可能通过调节滋养细胞中MMP-2、MMP-9与TIMP-1之间的平衡以及u-PA与PAI-1之间的平衡,而影响滋养细胞的侵袭能力。     

大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究

目的：建立基因工程化神经干细胞以便为生物医学应用提供材料。方法：（1）分离,培养胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素（Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝－200（NF－200）,胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化染色鉴定分化细胞。（2）用含有脑源性神经营养因子（BDNF）的复制缺陷型腺病毒感染神经于细胞,并用原位杂交检测。结果：（1）获得了大量未分化,呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞。（2）约80％－90％神经干细胞能被腺病毒感染,且经传代培养12代后仍具有干细胞特性。结论：从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞,经基因工程化及传代后,仍具有干细胞特性,可作为基础研究及神经移植供体,具有广阔应用前景。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

小型猪牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的:体外分离培养小型猪牙周膜细胞,为建立小型猪体内实验动物模型及进行牙周组织再生的研究奠定实验基础.方法:无菌拔除小型猪上下颌4颗切牙及4颗尖牙,采用组织块法原代培养小型猪牙周膜细胞并传代,绘制生长曲线,通过形态学和免疫组织化学染色方法对其进行鉴定.结果:组织块法成功培养小型猪牙周膜细胞,培养成功率为50%,其中切牙...     

骨巨细胞瘤体外原代培养及特性

目的观察骨巨细胞瘤体外培养细胞的形态生长特性及DNA倍体含量。方法取手术切取的骨巨细胞瘤新鲜标本8例,以组织培养法进行原代培养,观察细胞形态、生长曲线,FCM分析其倍体含量。结果骨巨细胞瘤原代培养种可见3种细胞;多核巨细胞可以长期培养。FCM分析显示:5例复发及2例原发病例是二倍体或亚二倍体,1例原发病例是非整倍体。结论单核梭形细胞是骨巨细胞瘤的主要肿瘤性成分;FCM无助于骨巨细胞瘤的预后判断。     

胚胎大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究

以低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)基因重组腺病毒体外转染胚胎大鼠神经干细胞,建立能稳定表达HIF-1α的基因工程化神经干细胞,为进一步的实验研究提供理论和物质基础.方法 ①分离SD大鼠胎鼠的间脑,加入神经生长因子EGF、bFGF和B27的神经干细胞务件培养基中克隆培养.通过检测神经干细胞的特异性抗原神经巢蛋白(nestin)、自我增殖能力和分化能力来鉴定神经干细胞;②用含有HIF-1α基因的腺病毒感染培养第2代的神经干细胞,通过绿色荧光蛋白的表达证明转染基因的表达,Western-blot检测转染后HIF-1α蛋白表达的变化,免疫原位杂交检测转染后HIF-1αmRNA 阳性细胞.结果 ①分离培养出了大量具有不断增殖能力的神经干细胞;②70%～80%的神经干细胞能感染HIF-1α基因重组腺病毒,Western-blot和免疫原位杂交实验显示HIF-1α蛋白大量表达.结论 成功建立了神经干细胞的分离培养方法及能长期稳定表达HIF-1α的基因工程化神经干细胞.     

Effect of ephrin-A1/EphA2 on invasion of trophoblastic cells

The effect of axon guidance factors ephrin-A 1/EphA2 on the invasion of trophoblastic cells and the possible mechanism were investigated in this study.The expression of EphA2 in vascular endothelial ce...