地高辛标记DHBVDNA探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛标记含鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）基因片段的质粒ＰＢＲ３２２作为探针，建立ＤＨＢＶＤＮＡ斑点杂交试验，结果：探针可检出１．０ｐｇ同源ＤＮＡ片段，不与人乙肝病毒（ＨＢＶ）及鸭肝细胞ＤＮＡ发生杂交，与￣３５Ｓ－ＤＨＢＶＤＮＡ探针的灵敏度相似。该探针检出重庆地区２－３月龄麻鸭血清ＤＨＢＶ自然感染率为２５．４８％；用ＤＨＢＶ血清经腹腔感染１－２日龄雏鸭，１周后阳性感染率为８２．９０％，并可持续感染至少２月。     

乙肝患者e系统转换对 HBV DNA 的影响

采用ＥＬＩＳＡ法和聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测了９４例乙肝患者及４０例乙肝病毒血清标志物（ＨＢＶＭ）阴性的肝炎患者。结果发现ＨＢｅＡｇ阳性者，有８６．０％ＨＢＶＤＮＡ阳性，二者具有明显的相关性，而抗ＨＢｅ阳性的病人，约４０．５％ＨＢＶＤＡＮ阳性，说明抗－ＨＢｅ的转换，不完全是病毒复制的终止，尤其是在慢性肝病患者中，抗－ＨＢｅ出现，部分患者体内仍可检出ＨＢＶＤＮＡ，病变仍处于活动中。     

慢性活动性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群与血清HBV—DNA的关系

对３３例血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性，３９例ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性的ＣＡＨ－Ｂ患者检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群。结果显示：７２例患者的ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４／ＣＤ８比值均明显低于正常人（Ｐ〈０．０１）；ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性组的ＣＤ４低于正常人（Ｐ〈０．０１）又高于ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性组（Ｐ〈０．０５）。提示，慢性ＨＢＶ感染可抑制Ｔ淋巴细胞亚群的增殖，而Ｔ淋巴细胞亚群的增殖低下、分化异常，尤其是ＣＤ４，又削弱     

HBx—DNA探针的研制及在肝癌发生机制研究中的应用

将非放射性标记物地高辛甙元用随机引物法由ｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ／ＥｃｏＲ Ｉ酶切片段（３．２ｋｂ）制备ＨＢＶ－ＤＮＡ探针及由ＨＢＶ／ＢａｍＨ Ｉ、Ｂｇｌ Ⅱ酶切片段（０．５９ｋｂ）制备ＨＢｘ－ＤＮＡ探针。将Ｄｉｇ－ＨＢＶ ＤＮＡ探针用斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转膜杂交检测筛选肝细胞性肝癌ＨＢＶ－ＤＮＡ整合型标本，进而用Ｄｉｇ－ＨＢｘ ＤＮＡ探针检测ＨＢＶ－ＤＮＡ纯整合型肝细胞性肝癌中ＨＢｘ的存在情     

慢性活动性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群与血清HBV－DNA的关系

对３３例血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性，３９例ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性的ＣＡＨ－Ｂ患者检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群。结果显示：７２例患者的ＣＤ＿３、ＣＤ＿４、ＣＤ＿８、ＣＤ＿４／ＣＤ＿８比值均明显低于正常人（Ｐ＜００１）；ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性组的ＣＤ＿４低于正常人（Ｐ＜０．０１）又高于ＨＢＶ一ＤＮＡ阴性组（Ｐ＜０．０５）。提示，慢性ＨＢＶ感染可抑制Ｔ淋巴细胞亚群的增殖，而Ｔ淋巴细胞亚群的增殖低下、分化异常，尤其是ＣＤ＿４，又削弱了机体清除ＨＢＶ的能力。     

HBV—DNA阳性者TNF—α,T细胞亚群检测及意义

采用ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ,对４０例ＨＢＶＤΝＡ阳性,２０例ＨＢＶＤＮＡ阴性者进行ＴＮＦα及Ｔ细胞亚群的检测,结果表明：ＨＢＶＤＮＡ阳性者,ＴＮＦα、ＣＤ８Ｔ细胞显著升高,ＣＤ４细胞及ＣＤ４／ＣＤ８的比值下降,ＴＮＦα与ＣＤ８Ｔ细胞有直接量的关系,即ＣＤ８Ｔ细胞增高,ＴＮＦα亦增高。由此可见,ＴＮＦ－α、Ｔ细胞亚群的检测对ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者的发病机理的探讨有一定意义。     

硫代反义寡脱氧核苷酸在树体内对HDV复制与表达的抑制作用

目的：在树（Ｔｕｐａｉａ）体内观察硫代反义寡脱氧核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＤＮ）对ＨＤＶ复制、表达的抑制作用。方法：树同时接种ＨＢＶ阳性血清０．１ｍｌ、ＨＤＶ阳性血清０．３ｍｌ后，将１６只ＨＤＶ／ＨＢＶ感染成功的树随机分为两组，给药组８只树按每只每次经尾静脉注射Ｓ－ＡＳＯＤＮ３ｍｇ，隔日１次，共７次。对照组中２只注射等量生理盐水，另６只不作处理。注射后５、１０、１５、２５ｄ取血及肝组织采用免疫组化、斑点杂交及原位杂交法检测ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲＮＡ。结果：于注射结束时（１５ｄ）给药组有７只树肝内ＨＤＶＡｇ及ＨＤＶＲ－ＮＡ转为阴性，对照组８只树中仅１只转为阴性。停止使用Ｓ－ＡＳＯＤＮ１０ｄ后，给药组２只阴转树肝内又可检出ＨＤＶＡｇ和ＨＤＶＲＮＡ，对照组仍有７只可检出。结论：Ｓ－ＡＳＯＤＮ在树体内能有效抑制ＨＤＶ复制及表达，但作用并不完全，可能与用药剂量不足，时间不够长及仅用硫代修饰尚不能直接导向靶基因有关     

非放射性HBV－DNA探针在乙型肝炎病毒检测中的应用

以地高辛甙元随机引物法标记ＨＢＶ－ＤＮＡ探针，以此探针检测慢性乙型肝炎患者的血清、肝组织，同时以ＥＬＩＳＡ法检测血清ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ。结果：血清ＮＢｅＡｇ阳性率２７％（１０／３７），血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率５７．１％（２０／３５），两者有显著性差异。血清ＨＢｃＡｂ阳性率７８．４％（２９／３７），肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率８３．８％（３１／３７），两者无显著性差异。血清与肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率有显著性差异。提示：血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检测是较ＨＢｅＡｇ更为准确客观反映血液带毒状况的指标。而准确反映肝脏带毒状况的指标是肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ检测。当ＨＢｅＡｇ阴转，血清ＨＢＶ－ＤＮＡ阴性而肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性时，需注意肝硬化及肝癌的发生。     

对单项HBsAg阳性长期意义的观察

目的：探讨单项ＨＢｓＡｇ阳性的长期意义。方法：选择两年内未经药物治疗及ＨＢＶ疫苗接种的原单项ＨＢｓＡｇ阳性者血清，分别用ＥＬＩＳＡ法或ＰＣＲ法检测ＨＢＶＭ或ＨＢＶ－ＤＮＡ。结果：检出五项ＨＢＶＭ，１２组ＨＢＶＭ组合类型，６８例ＨＢＶ－ＤＮＡ。ＨＢＶ－ＤＮＡ总阳性率为４９．２７％。结论：部分单项ＨＢｓＡｇ阳性可能转化为慢性乙肝。单项ＨＢｓＡｇ不能简单解释为无症状携带者。ＰＣＲ法较ＥＬＩＳＡ法更敏感、准确地反映ＨＢＶ在体内的复制。     

血清、白细胞HBV－DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＮＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。     

两种获取牙龈卟啉单胞菌基因组DNA方法比较

目的：筛选方便、快捷、有效地获取细菌基因组DNA的方法。方法：采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex-100法获取患者龈下菌斑DNA，比较作为PCR扩增模板检测牙龈卟啉单胞菌感染位点的检出率差异，并对2种方法进行比较。结果：试剂盒法与Chelex-100法对牙龈卟啉单胞菌的感染位点检出率差异无统计学意义，但Chelex-100法提取DNA更简单、快速。结论：Chelex-100法抽提细菌基因组DNA适用于对大样本牙周炎患者作细菌学检测分析。     

实时荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体方法的建立

目的建立检测贝氏柯克斯体的Real-Time PCR方法。方法根据贝氏柯克斯体特有的htpAB基因相关重复序列（IS1111a）进行PCR扩增片断485bp,以克隆的IS1111a基因片断作标准DNA模板,建立Real-Time PCR检测方法。结果建立的Real-Time PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0.999）;重复性测试Ct变异系数CV≤6.1%;其灵敏性约为普通PCR的10倍;以其它相关立克次体和病原菌DNA为模板应用于该方法,结果均为阴性。结论所建立的Real-Time PCR方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性,可代替普通PCR用于贝氏柯克斯体的感染早期的快速定性、定量检测。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA

目的 检验LightCycler实时监测PCR（real-time detection PCR,RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性，探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系。方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明，对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析。结果 实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高，可检测低至1000拷贝／ml血清；可重复性好，批间误差＜20％；各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明，HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系，一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高，但也有相当一部分例外。结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好；仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低，HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义。     

聚合酶链反应结合生物素探针杂交检测HBV DNA的应用

本研究将聚合酶链反应和生物素探针点杂交相结合,可直接从5μl 血清中检测到10fgHBV DNA。应用此方法检测20例 HBsAg 和 HBeAg 阳性病例,HBVDNA 均阳性;20例 HBsAg 阳性、HBeAg 阴性病例中,有8例阳性;20例健康献血员中,亦有1例检出 HBV DNA。结果表明这是一种灵敏可靠,适合于基础及临床广泛使用的 HBV DNA 非同位素检测法。     

巢式PCR检测人微小病毒B19非结构蛋白DNA的应用价值

目的 从临床流行病学的角度，对新的人微小病毒B19非结构蛋白DNA巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法的效度及信度进行评价，探索其运用于临床筛查B19病毒感染的可行性。方法 以国内目前常用的结构蛋白DNA巢式PCR检测结果，并结合孕妇的典型临床表现作为诊断标准，将30例孕妇分为B19病毒感染组及非感染组，对非结构蛋白DNA巢式PCR的检测结果进行效度及信度评价。结果 新的检测方法血清标本的灵敏度可达100％，组织标本的特异度及阳性预测值高于血清标本，联合试验有助于提高检测的灵敏度或特异度。结论 非结构蛋白DNA巢式PCR检测方法是一种特异、敏感、简便、快速诊断B19病毒感染的新方法。在临床筛查中，血清标本的检测优于组织标本。     

宫外孕组织沙眼衣原体感染的研究

建立检测沙眼衣原体的ＰＣＲ方法，计算机辅助设计的引物位于编码沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）的基因区内，扩增产物为１４４ｂｐ。该引物具有高度的特异性和敏感性，其最小检出量为５ｆｇ。应用该引物检测了５２份宫外孕组织中沙眼衣原体ＤＮＡ，测得宫外孕患者沙眼衣原体的阳性率为４０．４％，明显高于对照组的１２．５％（Ｐ＜０．０１），从ＤＮＡ水平证实在宫外孕组织内存在沙眼衣原体     

两种逆转录聚合酶链反应技术诊断中枢神经系统肠道病毒感染

目的：探讨一种迅速逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测脑脊液中肠道病毒（ＥＶ）ＲＮＡ。方法：引物序列选自ＥＶ５‘端非编码区。方法（Ａ）采用ＡＭＶ逆转录酶和ＴａｑＤＮＡ聚合酶,逆转录合成ｃＤＮＡ与ＰＣＲ在不同缓冲体系中分两步完成;（Ｂ）逆转录与在同一缓冲液中进行,ＡＭＶ逆转录酶和Ｔｆｌ ＤＮＡ聚合酶同时加入,逆转录后不再开反应管添加试剂。结果：通过检测不同稀释度的脊髓灰质炎病毒Ｉ型,柯萨奇病毒     

不同分子生物学方法检测乙型肝炎病毒DNA的研究

目的：研究不同分子生物学方法检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA的敏感性及影响因素。方法：用饱和酚抽提和血清蛋白变性后聚合酶链反应（PCR－1和PCR－2）检测48例慢性肝病患者的HBVDNA，并与分子斑点杂交法（Dot－H）检测结果进行比较。结果：Dot－H、PCR－1和PCR－2法对HBVDNA的检出率分别为70．83％、87．50％和91．67％，PCR－1和PCR－2中有17．02％表现为交叉阳性，慢性肝炎患者的检出率高于肝硬化患者，HBeAg阳性者高于其它HBV血清标志物（HBVm）阳性者。结论：PCR检测HBVDNA的敏感性高于Dot－H，所用PCR包含的多种引物可以提高HBVDNA的检出率。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。